[发明专利]羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用

说明书

本发明涉及羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用。具体公开了木糖发酵酵母羰基还原酶及其活性提高的突变体，其编码基因和氨基酸序列，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用所述木糖发酵酵母羰基还原酶或相应的重组表达转化体作为催化剂用于催化潜手性羰基化合物的不对称还原，特别是催化2‑氯‑2',4'‑二氟苯乙酮和2,2',4'‑三氯苯乙酮还原制备抗真菌化合物前体(R)‑2‑氯‑1‑(2',4'‑二氟苯基)乙醇和(R)‑2‑氯‑1‑(2',4'‑二氯苯基)乙醇的应用。与现有不对称还原的其他方法相比，本发明具有酶促反应底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及木糖发酵酵母羰基还原酶及其催化性能提高的突变体，该羰基还原酶及其突变体的编码基因和氨基酸序列，含有所述编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该羰基还原酶或重组表达转化体催化潜手性羰基化合物不对称还原，制备光学纯手性醇，特别是催化2-氯-2’,4-二氟苯乙酮和2,2’,4’-三氯苯乙酮不对称还原以制备光学纯抗真菌类药物中间体(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇的应用。

背景技术

(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇是合成咪康唑、嗌康唑及氟康唑等众多抗真菌类咪唑药物的重要手性中间体。这类抗真菌咪唑类药物合成的手性羟基砌块的光学纯度对药物的药效有极其重要的影响。

潜手性羰基化合物的不对称还原是制备高光学纯度手性醇的重要方法。手性醇的获得主要分为化学法和生物法。在化学方法中，常用硼氢化钠作为还原剂，在金属催化剂与相应手性配体配合作用下，催化生成相应的手性醇，但产品光学纯度往往不高，并且贵重的手性催化剂以及极端的催化条件限制了工业化的应用。

作为化学催化法强有力的竞争者，生物催化法正在起着越来越重要的作用。2005年，杨立荣等将2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮用硼氢化钠还原为消旋的2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇，再利用脂肪酶催化动力学转酯化拆分得到相应的(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(S)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇乙酸酯，然后在室温下将(S)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇乙酸酯水解为(S)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇，ee值分别为90.2％和94.5％。该方法操作步骤复杂，酶法拆分的理论得率仅为50％，并且反应的对映选择性偏低(CN 1765887B)。2009年，方岩雄等利用面包酵母中的氧化还原酶合成了(S)-2-氯-1-苯基乙醇衍生物，且ee值在97％以上。但是野生型面包酵母中还原酶表达量较低，并且本身含有多种杂酶，反应副产物较多。在所述的方法中面包酵母干细胞的添加量高达120g/L，导致产物的分离比较困难(CN 101503714A)。

专一性不对称催化还原2-溴-2’,4’-二氯苯乙酮、2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮及2,2’,4’-三氯苯乙酮的还原酶越来越多地被报道。例如，Duming Zhu等人利用醇脱氢酶PFADH成功获得ee值高达99％的(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇、(R)-2-氯-1-(3’,4’-二氯苯基)乙醇以及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇，但酶的活性偏低，反应时空产率仅为20g L^-1d^-1(J.Mol.Catal.B:Enzym.2009,56,272-276)。Gotor等人筛选了多种醇脱氢酶(ADH-T,ADH-CP,ADH-A等)，但在众多酶中仅ADH-T具有较好的活性及对映选择性，但是酶的底物耐受性差，最高底物浓度仅为6.7g/L(J.Org.Chem.2011,76,2115-2122.)。