[发明专利]一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法

权利要求书

1.一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)样品前处理

称取液体样品5.00g或者浓度为1g/mL的固体水溶液5mL于50mL离心管中，加入5mL提取液，10mL乙腈，涡旋充分混匀，以4500r/min离心5min，上清液转移至另一50mL离心管中，再在上清液中加入1g硫酸铵，充分混匀后离心5min，得到上层乙腈相和下层水相，取下层水相过硅藻土柱，下接50ml离心管，并加入0.5ml二甲基亚砜得到上样液；将上样液上硅藻土柱后平衡15分钟，然后将上层乙腈相过硅藻土柱进行洗脱，再依次用10ml，10ml，6ml乙腈清洗离心管中残余的上样液后，清洗液上硅藻土柱后，洗脱液用纯乙腈定容至25ml；将定容液均分为2份，分别置于15ml具刻度离心管中，在微弱的氮气流下吹干至1ml，用纯水定容至2ml，取出1ml置于1.5ml离心管中，于-4℃，15000r/min下离心10min，然后取400μL上清液置于带衬管的进样瓶中进样分析；同时做试剂空白样品；其中所述提取液的制备方法为：称取4.3g的草酸和3.7g的乙二胺四乙酸二钠，用500ml的水溶解，氨水调pH至3.0；

(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A.混合标准溶液组成：

磺胺类包括磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲异嘧啶，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺多辛，磺胺间甲氧嘧啶，磺胺对甲氧嘧啶，磺胺喹恶啉，磺胺二甲恶唑，磺胺二甲异恶唑，磺胺甲恶唑，磺胺噻唑，磺胺氯哒嗪，磺胺甲噻二唑，磺胺苯甲酰，磺胺苯吡唑，三甲氧苄胺嘧啶和磺胺胍，各成分浓度均为1.0μg/mL；

喹诺酮类包括乙胺嘧啶,环丙沙星,恩诺沙星,氧氟沙星,诺氟沙星,沙拉沙星,培氟沙星,奈啶酸,奥索利酸,氟甲奎,吡哌酸,西诺沙星,麻保沙星,司帕沙星,双氟沙星,单诺沙星,奥比沙星,洛美沙星和依诺沙星，各成分浓度均为1.0μg/mL；

激素类包括可的松，泼尼松，甲基泼尼松龙，炔诺酮，炔雌醇，醋酸美仑孕酮，己烷雌酚，己二烯雌酚，醋酸甲羟孕酮，雌酮，氢化可的松，孕酮，雌三醇，地塞米松，醋酸甲地孕酮，睾酮，泼尼松龙，雌二醇，己烯雌酚，甲睾酮，表睾酮，丙酸睾酮，苯甲酸雌二醇，追宝龙，诺龙，甲孕酮和17α-羟基孕酮，各成分浓度均为0.1μg/mL；

红霉素类包括红霉素，替米考星，竹桃霉素，泰乐霉素，克林霉素，螺旋霉素，吉他霉素，交沙霉素，林可霉素和泰妙菌素，各成分浓度均为0.1μg/mL；

孔雀石绿类包括孔雀石绿，隐色孔雀石绿，结晶紫和隐色结晶紫，各成分浓度均为0.1μg/mL；

青霉素类包括氨苄青霉素，乙氧萘青霉素，邻氯青霉素，头孢氨苄，双氯青霉素，青霉素G和阿莫西林，各成分浓度均为1.0μg/mL；

四环素类包括土霉素，强力霉素，金霉素和四环素，各成分浓度均为1.0μg/mL；氨苯砜类包括金刚乙胺，苯乙醇胺A，N-乙酰氨苯砜，氨苯砜，金刚烷胺，吡喹酮和氯丙嗪，各成分浓度均为0.1μg/mL；

B.基质标准曲线定量：

在空白样品中分别加入上述8类混合标准溶液0μL，10μL，20μL，40μL，100μL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据；其中响应值＝标准品峰面积/标准品质量；

(3)超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用测定

A.高效液相分离

色谱柱：Hypersile Gold C18色谱柱，若测定激素成分则采用的型号为100mmx 2.1mm,1.9μm，若测定混合标准溶液中的其余成分则采用的型号为100mmx 2.1mm,3μm；

若测定激素成分，则流动相A：含有0.1wt％氨水的甲醇溶液；流动相B：含有0.1wt％氨水的水-甲醇溶液，其中水与甲醇的体积比为95:5；

若测定混合标准溶液中的其余成分则：流动相A：含有0.1wt％甲酸以及5mM乙酸铵的乙腈-水溶液，其中乙腈与水的体积比为95:5；流动相B：含有0.1wt％甲酸以及5mM乙酸铵的水-乙腈溶液，其中水与乙腈的体积比为95:5；

流速：0.3mL/min；

进样量：10mL；

若测定激素成分HPLC洗脱程序如下：

若测定混合标准溶液中的其余成分则HPLC洗脱程序如下：

B.质谱检测

离子源：HESI-II；

喷雾电压：若测定激素成分则采用正离子模式3800V/负离子模式2700V；若测

定混合标准溶液中的其余成分则采用正离子模式3800V；

气化温度：350℃；

鞘气压：N₂，35arb；

辅助气压：N₂，10arb；

离子传输管管温度：300℃；

质量范围：m/z 100-1000；分辨率R＝70000；

(4)浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：

X＝2*C*V/m，式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L

V—定容体积，单位为mL；

m－试样体积或质量，单位为g。