[发明专利]一种基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法

权利要求书

1.一种基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法，其特征在于采用如下步骤：

a)选取一份来自同一母体的蚕卵在相同条件下孵育，待蚕破壳长大之后，将其等量随机分为A，B两组；

b)在A组蚕幼虫所食桑叶上喷淋含有碳纳米管的水溶液0.5～2.5mL，B组蚕幼虫所食桑叶不做处理，其他生长条件保持相同；

c)待幼虫吐丝结茧之后收集两组蚕丝分别以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na₂CO₃水溶液和质量分数为0.5～1.5％的SDS这两者的混合溶液中沸煮30min进行脱胶，共脱胶两次，1h之后，将溶液和丝素分离，丝素用去离子水冲洗并在50～60℃的烘箱中烘干；

d)将脱胶烘干的丝素纤维放入预先配好的CaCl₂:H₂O:乙醇为1:8:2的混合溶液中，浴比为1：25，加热到93～97℃蒸煮10～20min，获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，72h后得到丝素蛋白溶液,浓缩处理；

e)取浓缩之后的溶液加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液2～3mL于40～50℃下保持15～20min,待冷却至室温加入质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液4～5mL，黑暗环境下保持15～20min后加入50～80μL的胰凝乳蛋白酶溶液，然后用甲酸溶液稀释；

f)采用HPLC～MS/MS对其进行质谱分析，将结果与氨基酸序列数据库进行对比，比较A，B两组实验结果中的蚕丝蛋白氨基酸序列，B组与氨基酸序列数据库对比差别不大，分析A组，如果A组中氨基酸序列与B组存在明显的序列差异说明蚕丝加固对蚕丝蛋白的序列结构有影响，如果A组氨基酸序列与B组无明显差异说明蚕丝加固与氨基酸序列结构无关。

2.一种基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法，其特征在于采用如下步骤：

a)选取一份来自同一母体的蚕卵在相同条件下孵育，待蚕破壳长大之后，将其等量随机分为A,B两组；

b)在A组蚕幼虫所食桑叶上喷淋含有碳纳米管的水溶液1.5mL，B组蚕幼虫所食桑叶不做处理，其他生长条件保持相同；

c)待幼虫吐丝结茧之后收集两组蚕丝分别以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na₂CO₃水溶液和质量分数为1％的SDS这两者的混合溶液中沸煮30min进行脱胶，共脱胶两次,1h之后，将溶液和丝素分离，丝素用去离子水冲洗并在55℃的烘箱中烘干；

d)将脱胶烘干的丝素纤维放入预先配好的CaCl₂:H₂O:乙醇为1:8:2的混合溶液中，浴比为1：25，加热到95℃蒸煮15min,获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为11000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，72h后得到丝素蛋白溶液,浓缩处理；

e)取浓缩之后的溶液加入质量分数为1.7％的二硫苏糖醇溶液2.5mL于45℃下保持17min,待冷却至室温加入质量分数为2.5％的碘乙酰胺溶液4.5mL，黑暗环境下保持17min后加入65μL的胰凝乳蛋白酶溶液,然后用甲酸溶液稀释；

f)采用HPLC～MS/MS对其进行质谱分析，将结果与氨基酸序列数据库进行对比,比较A,B两组实验结果中的蚕丝蛋白氨基酸序列，B组与氨基酸序列数据库对比差别不大，分析A组，如果A组中氨基酸序列与B组存在明显的序列差异说明蚕丝加固对蚕丝蛋白的序列结构有影响，如果A组氨基酸序列与B组无明显差异说明蚕丝加固与氨基酸序列结构无关。