[发明专利]一种生防菌挥发性代谢物的检测方法

权利要求书

1.β-倍半水芹烯在防治烟草真菌、细菌病害中的应用，其中，所述烟草真菌、细菌病害为烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、赤星病菌和炭疽病菌。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，β-倍半水芹烯是生防菌短小芽孢杆菌AR03的一种挥发性代谢产物，所述检测方法包括：

(1)生防菌培养：取培养基倾倒于无菌顶空瓶中冷却凝固，取生防菌发酵液涂布于培养基表面，加盖密封；同时设置空白对照组，所述空白对照组不添加生防菌发酵液；

(2)空白样品挥发物收集：将步骤(1)中获得的空白培养基的顶空瓶在室温中静置一定时间后，进行采样；采样时用铁架台固定萃取探针和顶空瓶，将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管；萃取头置于顶空瓶的上部空间；收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；

(3)细菌挥发物收集：将步骤(1)获得含生防菌的顶空瓶在室温中静置一定时间后，进行采样，采样前首先向顶空瓶侧壁注入1-十五烯内标溶液，注意尽量避免接触培养基基质，然后将SPME针管刺入顶空瓶，将萃取头置于顶空瓶上部空间，采集细菌挥发性代谢物，收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；

(4)吸附正构烷烃C10-C20萃取头制作：将正构烷烃C10-C20溶液于顶空瓶中，在室温中静置一定时间后，进行采样；将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管；萃取头置于样品的上部空间，采集气态正构烷烃；收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；

(5)挥发物定性分析：将步骤(2)、(3)获得含挥发物的探针以及步骤(4)吸附正构烷烃C10-C20的探针，在全扫描模式下进行分析，得到空白基质挥发物、细菌挥发性代谢物和正构烷烃C10-C20的总离子流图；

(6)细菌挥发性代谢物鉴定：将步骤(5)获得细菌挥发物总离子流图，扣除空白样品挥发物总离子流图中共有色谱峰，即为挥发性代谢物特征指纹峰，经NIST和WILIY谱库对总离子图中化合物进行定性识别，对于识别的每种代谢物，根据其相邻正构烷烃的保留时间和碳原子数，计算该代谢物的保留指数，然后查阅NIST Chemistry WebBook中报道的该组分在相同色谱柱中的保留指数进行验证；

(7)细菌挥发代谢物定量分析：将步骤(2)、(3)和(4)中获得含挥发性有机物的探针，进GC-MS分析，根据步骤(6)获得的挥发性代谢物的鉴定结果，以1-十五烯溶液作为内标参照，采用内标法计算各色谱峰对应代谢物的相对含量；

所述GC-MS所采用的条件为：色谱柱DB-5MS弹性毛细管色谱柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm；进样口：大体积进样口，冷不分流模式，初始温度40℃，以100℃/min速率升至250℃，解吸时间4min；载气为99.999％氦气，流速为1.0mL/min；柱温箱：初始温度40℃，保持2min，以5℃/min速率升至180℃，保持10min，以10℃速率升至280℃，保持15min，总运行时间为55min；EI离子源；全扫描模式，扫描范围30-400amu；

其中，生防菌短小芽孢杆菌AR03已于2010年8月23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.4117。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备方法为：葡萄糖15g，酵母粉1g，胰蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂15-20g，加水定容至1000mL，调pH至7.0，121℃灭菌20min。

4.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述1-十五烯溶液的浓度为2μg/mL，溶剂为甲醇。

5.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤(6)中进行定性识别时设置匹配度阈值为80。