[发明专利]一种生防菌挥发性代谢物的检测方法

说明书

本发明公开了一种生防菌AR30挥发性代谢物的检测方法，包括：(1)将细菌发酵液涂布于培养基上，所述培养基置于顶空瓶中；(2)采用固相微萃取技术收集细菌挥发物；(3)用配置多模式进样口的气相色谱‑质谱联用仪，在全扫描模式下结合商业谱库检索和正构烷烃保留指数匹配的方式对细菌挥发物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果，对细菌挥发物含量进行定量分析。该方法能够有效解决不稳定、易降解的活性挥发物的收集、鉴定及定量检测问题，掌握细菌胞外挥发性代谢物分子时空动态信息，为研究生防菌的抗菌机理、作用方式及其在生物防治领域中的应用提供支持，为丰富抗菌物质种类和挖掘新的抗菌基因提供理论基础。

技术领域

本发明属于活性代谢物检测技术领域，涉及一种生防菌挥发性代谢物的检测方法。

背景技术

本发明所涉及的生防菌AR03是从土壤根际细菌中筛选出一株性状良好的细菌菌株，经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，该菌株及其在植病生防中的应用已获得国家发明专利(ZL.201110146683.8)。该菌株对果蔬作物青枯病菌(RalostoniaSolanacearum)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、烟草黑胫病菌(Phytophoranicotianae)、烟草炭疽病菌(Colletotrichum nicotianae Av.-Sacca)和烟草白粉病(Erysiphe cichoracearum DC)等多种植物病原真菌和细菌有明显的抑制作用；另外AR03菌株对烟株还具有促生作用，在灭菌土条件下，经AR03处理后的整株干重和根干重比对照增加121.8％和176.7％；在自然土条件下，整株干重和根干重比对照增加了17.2％和14.4％。

生防细菌对植物病原真菌病害的防病机制，主要包括抗生竞争诱导抗性及寄生等多种方式，其中通过分泌胞外代谢物抑制病原的生长和代谢是抗生作用的主要方式。因此，验证菌株拮抗活性的重要指标是该菌株的发酵上清液具有抑菌作用，即抗菌活性物质的提取是通过生防菌株的发酵滤液来完成。在研究该菌株对植物病原真菌和细菌拮抗作用的过程中发现，不同浓度AR03菌悬液(发酵原液、稀释30倍、100倍、200倍)对真菌菌丝形态，分生孢子萌发表现出较强的抑制作用，但其除菌上清液无抑菌活性。因此我们初步判断该菌株产生的具备抑菌活性的胞外代谢物不是存在于菌液中，而是以挥发态存在。对该菌株胞外挥发性抗菌物质进行鉴定和定量分析，对于进一步研究AR03菌株对病原菌的抗菌机理、作用方式及其田间防治提供支持，为丰富抗菌物质种类和挖掘新的抗菌基因提供理论基础。

目前，挥发性有机物的收集方式主要有液液萃取(LLE)、水蒸气蒸馏(SD)、同时蒸馏萃取(SDE)、热脱附(TD)、吹扫捕集(P&D)、超临界萃取(SFE)、固相微萃取(SPME)等，其中LLE、SD、SDE是传统的提取方法，对人员、仪器配置要求不高，是挥发性成分收集的常用方法，但这些传统方法通常需要耗费较长的提取时间、大量的溶剂和繁琐的操作过程，此外高温的蒸馏过程会导致许多热不稳定的挥发性有机物降解，测的结果不能反映目标物的真实组成。而TD、P&T、SFE这三种提取方式均需要专门的设备，对人员和仪器配置要求都较高，且不太适用于痕量挥发性有机物的收集。SPME是近年来应用较为广泛的一种样品前处理技术，它的发展就是为了适应实验室和现场样品的快速处理的需求，其操作通常将少量具有吸附功能的涂层材料固定于基质表面，直接或间接接触样品，然后进行脱附分析。传统的分析方法和样品预处理技术存在的缺点固相微萃取技术几乎都能克服，该技术集取样萃取浓缩于一体，无需溶剂，具有快速高效成本低安全性高，能够与其他仪器联用等众多优点，使得样品处理技术及分析操作简单省时，因此成为目前最常用应用最广泛的样品预处理方法之一。近几年有大量的SPME研究论文出现，其中应用最多的是食品分析领域，在细菌挥发性代谢物研究方面还处于刚刚起步阶段。