[发明专利]产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的微生物及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种形成含有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，所述方法包括：

(a) 向间歇式反应器提供工程化非植物细胞以及包含营养物和水的原料，所述工程化非植物细胞具有导致相对于非工程化非植物细胞过度产生酪氨酸的以下修饰：反馈抑制减轻突变、转录调节修饰和失活突变，

其中所述反馈抑制减轻突变与第一酶相关，所述第一酶选自：3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶和分支酸变位酶，

所述转录调节修饰增加第二酶的表达，所述第二酶选自：转酮醇酶和苯丙酮酸脱羧酶，以及

所述失活突变与第三酶相关，所述第三酶为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；

(b) 在所述间歇式反应器中，通过将所述工程化非植物细胞培养至少约5分钟的时间使所述工程化非植物细胞发酵，以产生包含所述苄基异喹啉生物碱产物和细胞材料的溶液；和

(c) 使用至少一个分离单元将所述苄基异喹啉生物碱产物与所述细胞材料分离以提供包含所述苄基异喹啉生物碱产物的产物流。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液包含不超过一种类别的选自以下组的分子：原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述工程化非植物细胞是工程化酵母细胞。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述工程化非植物细胞包含编码3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一个或多个反馈抑制减轻突变存在于所述3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶基因中。

6.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述工程化非植物细胞包含编码分支酸变位酶的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一个或多个反馈抑制减轻突变存在于所述分支酸变位酶基因中。

8.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述间歇式反应器的至少一个工艺参数是可修改的，以改变所得的苄基异喹啉生物碱产物组成，其中所述可修改的至少一个工艺参数包括溶解氧、pH、搅拌速度、通气速率和细胞密度中的至少一个。

9.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物选自以下组：去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、酪氨酸、酪胺、4-羟基苯乙醛、4-羟基苯丙酮酸、L-3,4-二羟基苯丙氨酸、3,4-二羟基苯乙醛和多巴胺。

10.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物是具有选自以下组的结构类别的苄基异喹啉生物碱：苄基异喹啉、原小檗碱、原阿片碱、苯并菲啶、原吗啡喃、吗啡喃、断裂小檗碱、苯酞异喹啉、阿朴啡和双苄基异喹啉。

11.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述产物流不包含多于5 ppm的选自以下组的分子：木质素、色素、类黄酮、类菲、乳胶、核酮糖二磷酸羧化酶、袂康酸、假吗啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。

12.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述产物流不包含可检测量的选自由杀虫剂、杀真菌剂或除草剂组成的组的物质。

13.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述工程化非植物细胞包含三个异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将酪氨酸转化为所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的第一酶、第二酶和第三酶，其中所述第一酶、第二酶和第三酶沿所述代谢途径可操作地连接。