[发明专利]产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的微生物及其制备和使用方法

说明书

本文提供了用于产生苄基异喹啉生物碱产物的方法和工程化酵母细胞。一种方法包括向反应器提供工程化酵母细胞和原料。在所述反应器中，通过将所述工程化酵母细胞培养一段时间使所述工程化酵母细胞发酵，以产生包含BIA产物和细胞材料的溶液。所述溶液包含不超过一种类别的选自以下组的分子：原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和苄基异喹啉。此外，使用至少一个分离单元将所述BIA产物与所述细胞材料分离以提供包含所述BIA产物的产物流。

政府权利

本发明是在由国家科学基金会颁发的1066100号合同和国家卫生研究院颁发的DAT007886A号合同所给予的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2015年5月4日提交的美国临时专利申请第62/156,701号的申请日的优先权，所述申请的公开内容通过引用并入本文。

此外，本申请涉及：美国专利申请第14/211,611号，现已公布为US 2014-0273109，该申请于2014年3月14日提交，并具有代理人档案号STAN-1018；PCT申请第PCT/US2014/027833号，现已公布为WO2014/143744，该申请于2014年3月14日提交，并具有代理人档案号STAN-1018WO；以及PCT申请第PCT/US2014/063738号，该申请于2014年11月3日提交，并具有代理人档案号STAN-1078WO，这些申请的公开内容通过引用并入本文。

发明背景

苄基异喹啉生物碱(BIA)是来自植物和其它生物体的一大群次生代谢物。这些分子在人体中具有治疗作用，包括从吗啡和可待因的已知的镇痛和止咳性质到针对黄连素和血根碱等分子观察到的对抗癌症和感染的新型活性。供应所有这些BIA分子以使得它们可供研究人员和医师使用是令人感兴趣的。合成反应的数目和对选择性立体化学的要求意味着BIA的化学合成是低产率的并且不是用于大规模生产的可行手段。相反，对于广泛使用的可待因和吗啡药物，鸦片罂粟(Papaver somniferum)已经作为生产作物繁殖和发育。适用作药物和药物前体的吗啡生物合成中的中间体不会积累，因为植物代谢演化为使产生最终阿片类物质的途径的通量最大化。即使对于终产物代谢物像吗啡，积累也仅发生在芽组织和维管组织中的特化细胞内，并且需要在提取过程中对收获的植物材料进行严苛的化学处理，这样可以产生按干重计少于2％的吗啡。因此，用于制备BIA的方法是令人感兴趣的。

发明内容

提供了被改造来产生目标苄基异喹啉生物碱(BIA)如去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)的宿主细胞。目标BIA可以包括BIA前体、BIA和BIA修饰。所述宿主细胞可以具有选自以下的一种或多种修饰：酶基因中的反馈抑制减轻突变；生物合成酶基因的转录调节修饰；酶的失活突变；以及异源编码序列。还提供了使用所述宿主细胞产生目标BIA的方法以及在本发明的方法中使用的组合物(例如试剂盒、系统等)。

本发明的一个方面提供了一种形成含有苄基异喹啉生物碱(BIA)产物的产物流的方法。所述方法包括向间歇式反应器提供工程化酵母细胞和包含营养物和水的原料，所述工程化酵母细胞具有选自由以下所组成的组的至少一种修饰：在所述细胞中天然存在的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；在所述细胞中天然存在的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及在所述细胞中天然存在的酶的失活突变。另外，所述方法包括，在间歇式反应器中，通过将工程化酵母细胞培养至少约5分钟的时间使工程化酵母细胞发酵，以产生包含BIA产物和细胞材料的溶液。所述方法还包括使用至少一个分离单元将BIA产物与细胞材料分离以提供包含BIA产物的所述产物流。