[发明专利]荧光检测方法和系统

说明书

本发明涉及多重荧光检测，包括时间分辨荧光(TRF)检测。使用荧光发射中的光谱和时间差异以及激发中的光谱差异的组合来增强从多种荧光标记物的测定中分离信号的能力。可以使用不同种类的标记物，包括上转换荧光粉以及镧系元素螯合物和过渡金属螯合物。该方法可以在光学读板仪中实施，该光学读板仪包括基于盒的多模式读取器。

相关申请

本申请要求于2015年4月8日提交的美国专利申请序列No.14/682,026的优先权，该申请的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及用于样品的基于荧光的检测或测量的方法、装置和系统，特别是利用不同荧光团的多重检测。本发明可以实施用于基于荧光的检测的不同类型的技术，包括常见的荧光检测(FD)和时间分辨荧光(TRF)检测。

背景技术

蛋白质检测和表征是制药和临床研究的重要任务。化学发光(CL)是在生物化学分析中用于蛋白质检测的常用方法，或者是表面结合和空间分离蛋白质中检测蛋白质的常用方法。后者的实例是十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法，其中将蛋白质电泳转移到膜上，该方法被称为Western Blot(WB)分析(Towbin等人(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76(9):4350-4354；Renart等人(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76(7):3116-3120)。电化学发光(ECL)也已经被用于检测特殊设计的多孔板中结合斑点的蛋白质(例如，MULTI和MULTl-ARRAY^TM板和SECTOR^TM仪器，Meso Scale Discovery，Meso Scale Diagnostics的部门,LLC,Gaithersburg,Md.)。

CL和ECL的优点是灵敏度非常高，其中溶液中蛋白质的检测限在亚皮克/ml的范围内。然而，这些系统产生瞬态信号，不是化学稳定的，并且需要复杂的程序来产生检测所需的化学反应。这些系统也是非线性系统(即一个探针产生许多光子)并且可再现性差，因此不适合需要对蛋白质的量进行定量的应用。最后一个非常重要的限制是无法多重检测多个CL信号。这些CL信号的发射非常广泛，这使得检测发射自同一空间位置的两种不同的CL发射的能力非常具有挑战性。

荧光(FL)探针克服了CL的一些限制。由于激发光子与发射光子之间的关系通常是线性的，因此荧光探针提供了进行更好的定量的能力。荧光探针也更通用，因为不需要通过其他反应性分子来接触探针。一般而言，FL探针也更加稳定(特别是在避光时)，因为FL探针通常是非反应性的化学物质。FL探针的最重要的优点也许在于它们提供了进行多重荧光检测(multiplexing)的能力。FL分子以各种各样的形式出现并且具有宽范围的激发带和发射带。因此，在相同空间位置处的两个(或更多)探针可以被独立地激发和检测，并且检测通道之间的重叠(或串扰)被降至最低。通常使用彩色带通滤波器来报告从相同空间位置检测多达四个独立荧光团的能力。已经报道了流式细胞术和多光谱成像具有更高水平的多重荧光检测(Stack等人，(2014)Methods 70(1):46-58；Perfetto等人，(2004)4(8):648-655)。