[发明专利]肾细胞癌的预后判定方法

说明书

本发明提供一种迅速、简便且高精度的癌预后判定方法。一种含有肾细胞癌的组织的判定方法，包括以下工序：(1)将样品DNA供于离子交换色谱的工序，该样品DNA是用亚硫酸氢盐处理由受检者的肾脏组织制备的靶基因组DNA后进行PCR扩增而得到的；(2)算出该色谱的检测信号的微分值的工序；(3)工序(2)中算出的微分值具有2个以上的极大值的情况下，将该肾脏组织判定为预后不良的含有肾细胞癌的组织的工序。

技术领域

本发明涉及利用了甲基化DNA的检测的肾细胞癌的预后判定方法。

背景技术

近年来，清楚地知道DNA的异常甲基化深度参与癌化，受到了关注。作为癌细胞的特异性表观遗传异常，已知有部分的基因启动子区域中的CpG岛的异常DNA甲基化。CpG岛是介由磷酸二酯键(p)的胞嘧啶(C)－鸟嘌呤(G)二碱基序列高频出现的区域，大多存在于基因上游的启动子区域。CpG岛的异常DNA甲基化通过使抑癌基因失活等而参与癌变。在大肠癌、胃癌等中，已经报告了与临床病理学因素相关的CpG岛的DNA甲基化亢进(非专利文献1～4)，这种类型的癌被称为CpG岛甲基化表型(CIMP)阳性癌。

作为已经确立的甲基化DNA的分析方法，有利用亚硫酸氢盐(重亚硫酸盐、酸性亚硫酸盐、bisulfite)反应的方法。该方法是在甲基化DNA的分析中最常用的方法。如果用亚硫酸氢盐处理单链DNA，则胞嘧啶经过磺化、水解脱氨化、脱磺化而转变成尿嘧啶。另一方面，由于被甲基化的胞嘧啶最初发生的磺化的反应速度极其缓慢，所以在实际进行的亚硫酸氢盐处理的反应时间中仍保持为甲基化胞嘧啶。因此，如果使用经亚硫酸氢盐处理过的DNA进行PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶链式反应)，则甲基化胞嘧啶仍保持为胞嘧啶，但非甲基化胞嘧啶被从尿嘧啶替换成胸腺嘧啶而扩增。利用该PCR扩增产物在序列中产生的胞嘧啶和胸腺嘧啶这样的碱基的差异来分析甲基化状态。以此为基本原理通用的方法有专利文献1、非专利文献5中记载的Methylation－Specific PCR(MSP)法、以及非专利文献6、7中记载的Combined Bisulfite Restriction Analysis(COBRA)法。MSP法和COBRA法从无需特别的装置就能够进行甲基化DNA的定量分析这点来看现在仍是广泛使用的甲基化DNA分析方法，但从在分析中利用电泳法这点来看存在耗费精力和时间这样的课题。

作为其它的甲基化DNA分析方法，有焦磷酸测序。在该方法中，将经亚硫酸氢盐处理过的DNA的PCR扩增产物供于焦磷酸测序，检测替换成胸腺嘧啶的甲基化胞嘧啶。但是，存在以下课题：焦磷酸测序需要专用的测序仪，另外由于是逐个读取碱基的方法，所以分析花费时间。

最近，提出了通过将经亚硫酸氢盐处理过的DNA的PCR扩增产物供于离子交换色谱，基于该色谱的检测信号的保留时间判定DNA的甲基化率的方法(专利文献2)。该方法与以往的利用电泳、焦磷酸测序的甲基化DNA分析方法相比，具有分析的时间大幅缩短的优点。

肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma：RCC)常发生于劳动人口的壮年期，大部分是通过肾摘除手术根治的病例组，但相反地，也明显存在迅速远处转移(distant metastasis)的病例组，两者的临床经过有很大差异。此外，已知即便转移也有免疫疗法·分子靶向治疗药等成功的病例。复发可能性高的病例如果经过密切观察而早期诊断复发，并追加后续疗法，则有可能改善预后。但是，接触过虽然属于病理组织学上为低异型性且为最常见的组织型的透明细胞型RCC但发生迅速远处转移的病例，难以利用现有的临床病理学因素等进行预后预测。

通过利用了MSP法、COBRA法、以及基于细菌人工染色体(BAC)阵列的甲基化CpG岛扩增法(BAMCA法)的分析，指出了从RCC患者得到的非癌肾皮质组织已经处于伴有DNA甲基化状态的变化的癌前病变阶段(专利文献3以及非专利文献8～11)。并且，通过基于BAMCA法的全基因组分析，明确了处于癌前病变阶段的非癌肾皮质组织的DNA甲基化的变化来自相同患者的对应的RCC，另外基于该方法成功研究出预测RCC病例的预后的方法(专利文献3和非专利文献10)。