[发明专利]一种分子标签核酸检测方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA核酸检测领域，具体涉及一种用于检测脱氧核糖核酸中具体碱基突变、SNP的定性、定量方法。

背景技术

高通量测序是通过大规模平行测序，每次检测数千万条序列，可以快速廉价地进行DNA检测。然而目前大规模测序的整体错误率仍然较高，市场上主流的高通量测序仪的错误率基本在1～2％作用。错误率主要来自于测序过程本身会有一定的错误，同时PCR扩增过程中，也有PCR出错的可能，也存在某一个特定模板得到大量扩增，此位点在原有模板中真正的含量没有办法估算，最终只能得到一个定性的结果，常规的建库方法来直接进行高通量测序很难进行精准的定性和定量。

在肿瘤液态活检中，外周血中存在来自肿瘤脱落细胞的低峰度突变，希望可以做到万分之一的灵敏度，以便能更早发现肿瘤、及术后伴随诊断，及时调整有效的靶向药物。

常规的单基因病检测、诊断方法需要抽取羊水，在羊水中的胎儿脱落细胞为检测基质，进行PCR、荧光定量PCR、基因芯片或高通量测序。1997年科学界发现在孕妇外周血中含有胎儿的DNA，从而一直希望可以无需抽羊水，通过孕妇的外周血浆中检测无创地来检测胎儿是否有单基因病遗传。胎儿DNA在孕妇外周血浆中占比在10％左右，胎儿DNA中有50％来自于母亲，还有50％来自于父亲。如果要进行无需羊水穿刺的无创单基因病检测，遇到的最大挑战就是如何精准定量外周血中的突变和SNP，避免母体遗传的高背景造成的干扰。

综合高通量测序仪技术本身的错误率，以及肿瘤液态活检、无创单基因病的检测本质需求，迫切需要开发能区分测序错误、系统错误，最终灵敏地定性定量分析碱基突变的技术流程。

发明内容

鉴于肿瘤液态活检需要极高的灵敏度，万分之一的检测灵敏度；无创单基因病检测要求能精准定量突变频率，从而判断孕妇所怀小孩是否带有单基因遗传病，需要开发能降低测序错误，并能检测微量突变的技术。

常规的高通量测序需要构建一个测序文库，测序文库主要是在待测DNA的两端接上通用的DNA接头，该接头序列和后续测序仪所使用的测序芯片进行杂交后，测序仪从DNA接头上的通用位置开始测序。为了确定单基因突变，通常需要对特定模板测序100次以上，如果随机出现的低频突变，会被认为是测序错误或者是PCR扩增中引发的错误而被忽略，因此常规的方法适合于来自于体细胞的突变检测，并不适用于检测样本中含有极低含量突变的样本。

本发明提供了一种新型建库方法和分析手段，两者的结合，从而可以将以往没有办法区分的测序错误、PCR错误等等降到最低，从而实现精确定性定量低频突变。

一种分子标签核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)待测脱氧核糖核酸(DNA)中加入DNA末端补平酶和dNTP，补平DNA末端，并在DNA的3’端增加碱基A；

2)直接往步骤1反应体系中加入DNA连接试剂，使步骤1所得产物与带有多个分子标签的DNA接头连接；

3)使用通用引物进行PCR扩增；

4)将步骤3所得扩增产物和捕获探针进行杂交，得到捕获产物；

5)捕获产物用带有样本识别作用的分子标签引物进行扩增，最终产物用于高通量基因测序；

6)测序后，通过接头两端序列可以获知DNA两端在染色体的起始位置，综合分子标签、DNA片段的起始位置双重校正因素得出测序结果：1.标签序列一致，DNA起始位置一致的为一个来源的DNA；2.标签一致，起始位置不一致的为不同模板DNA；3.标签不一致，起始位置一致为不同模板DNA；4.标签不一致，起始位置不一致为不同模板来源DNA。

本方法的创新在于，对常规DNA接头进行了结构修改，在通用部分和待测片段之间增加了分子标签的序列，分子标签可以为数个DNA碱基；和以往建库方法都不同的是，在一个样本中同时加入多个分子标签的DNA接头，待测DNA和接头连接后可能会出现两端为同一标签序列接头或者不同标签序列接头。

连接后的产物，通过接头中的通用部分进行扩增，增大模板量，随后和捕获探针进行杂交。捕获探针为特定目标片段、区域DNA的互补序列组合，可以为DNA或RNA探针。捕获的意义在于可以一次抓取多个位点或区域的DNA进行检测，不仅加快了获得特定片段的速度，同时也降低后期的测序费用，只需要对研究感兴趣的区域进行测序就可以。

完成捕获以后，采用和DNA接头通用部分互补引物进行扩增，此引物内含有针对该样本本身的唯一对应的序列标签，通过此次扩增，完成了文库构建。