[发明专利]一种提高极低拷贝数目标DNA检测灵敏度的方法

权利要求书

1.一种提高极低拷贝数目标DNA检测灵敏度的方法，其特征在于，主要步骤如下：向待检测样品DNA中加入外源背景基因组DNA；使用特定的可以对目标DNA切割产生随机碱基粘性末端的限制性内切酶对混合后的样品DNA进行酶切；根据目标DNA切割后所产生的粘性末端设计与之互补的接头并与之进行连接；使用接头中含有的通用引物对连接产物进行PCR反应；以PCR产物为模板，使用针对目标DNA设计的特异性引物进行特异性核酸扩增检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤为：

a)向待检测样品DNA中加入终浓度为10-500ng/μL的外源背景基因组DNA；

b)使用可以对目标DNA切割产生随机碱基粘性末端的限制性内切酶对步骤a)得到的样品进行酶切，酶切反应参数由所选内切酶确定；

c)向酶切产物中加入针对目的基因酶切片段设计的双链DNA接头，并在DNA连接酶的作用下进行连接反应，使酶切片段的两端均连接上接头，所述接头上均带有通用引物序列，接头最终浓度为50-400nM，连接反应参数根据所选连接酶确定；

d)以连接产物为模板，使用通用引物进行PCR反应，反应参数根据最终目标片段长度确定；

e)以上一步PCR反应产物为模板，使用目标DNA的特异性引物进行PCR、LAMP或RCA对目标基因的最终检测，反应条件及参数根据所选特异性检测方法确定。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤a)所述外源背景基因组DNA包括所有真核生物的基因组DNA。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤a)所述外源背景基因组DNA为鲑鱼精DNA。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述限制性内切酶是一类可以对目标DNA切割产生随机碱基粘性末端的内切酶，选择识别位点为4-6碱基、产生的粘性末端长度为4-9碱基内切酶，且所选内切酶应至少在目标基因中含有两个酶切位点或使用两种在目标基因中各含有一个酶切位点的内切酶。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤c)中所述接头由两条长度不同的单链DNA组成，其中长链部分5’端含有一段通用引物序列，短链部分5’端含有可与目标基因酶切片段粘性末端完全互补配对的“衔接”序列，长链与短链之间含有≥8碱基的互补配对部分。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶包括Alw26I，BbvI，FokI，HgaI，TspRI。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤c)中所述DNA连接酶主要包括T3、T4、T7 DNA连接酶以及E.coli DNA连接酶和Taq DNA连接酶，所述DNA连接酶的连接时间为0.5-2.5h。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤d)中所述通用引物指的是一段寡核苷酸序列，同时也是所有双链DNA接头的长链部分，长度为18-26个碱基，熔点为60℃±5℃，通用引物在PCR体系中的浓度为0.1-1μM。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤e)中所述特异性引物为针对目标酶切片段所设计，扩增产物为目标片段内部的一段DNA序列。