[发明专利]一种提高极低拷贝数目标DNA检测灵敏度的方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种提高现有核酸检测技术对极低拷贝数目标DNA检测灵敏度的方法。

背景技术

基于体外DNA扩增技术的核酸检测方法具有高灵敏度与高特异性的优点，比较具有代表性的是PCR(变温反应)以及环介导等温扩增(LAMP)，在生物学、医学、环境科学、法医学、食品科学等领域发挥着极其重要的作用。在食品安全检测领域，传统的微生物培养鉴定法需要数天检测周期，而核酸检测方法在几小时内便可完成，且灵敏度与特异性均高于传统方法；在医学领域核酸检测方法被广泛应用于多种疾病的快速准确检测以及药物研发等多种项目中；在法医学中DNA检测是侦办各类刑事案件的重要手段。

但是核酸检测法高灵敏度结果的获得往往需要在使用较为理想的样品的条件下获得，相对于一些目标DNA数量极低(或极微量目标DNA混杂于大量背景核酸中)的样品，核酸检测方法的灵敏度与特异性可能降低从而导致假阴性或假阳性的结果，如医学检测中“分析”灵敏度与“临床”灵敏度不一致的情况。为此，针对这一类样品进行纯化以消除大量背景核酸的影响成为提高这类样品检测效率的方法之一，如美国专利US 13/933,919(Richmond et al,2013)公开了一种利用阴离子交换技术从大量背景核酸中选择性富集特定片段长度DNA的方法，但该方法适用于较大量样品的纯化且需要制备特定的阴离子交换微珠，极低数量的目标DNA容易在吸附和洗脱过程中丢失；Zhou等报道了一种特异性去除人基因组DNA从而提高血液样品中沙门氏菌检测灵敏度的方法，其先使用牛胆汁和微球菌核酸酶将人基因组DNA降解后再单独提取沙门氏菌DNA进行检测，但此方法只适合于全血样品的处理且操作过程相对较为繁琐(Zhou L,Pollard A J.A novel method of selective removal of human DNA improves PCR sensitivity for detection of Salmonella Typhi in blood samples[J].BMC infectious diseases,2012,12(1):164.)。针对不含背景核酸的纯DNA样品，虽然PCR法可以达到理论上1拷贝的检测灵敏度，但由于需要极其严格的实验环境以及最优的实验条件(引物、试剂、参数等)，因此实际操作中因很难达到这一目标，很多文献报道中PCR的检测阈值约为100拷贝甚至更多(王怡倩，叶长芸.建立检测产气肠杆菌的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR方法[J].疾病监测,2016,31(2):153-158；Sritunyalucksana K,Srisala J,McColl K,et al.Comparison of PCR testing methods for white spot syndrome virus(WSSV)infections in penaeid shrimp[J].Aquaculture,2006,255(1):95-104.)，增加扩增循环数虽可一定程度上提高检测灵敏度但同时增加了假阳性风险。

显然，如果研发一种成本低廉、操作简便、对实验设备等要求低的方法可以提高极低丰度(低于百万分之一)DNA的检测灵敏度，同时保证检测的高特异性，将有效提高核酸检测方法在各种实际复杂情况下检测的效率，应用前景广阔。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提供一种高效、简便的可以提高现有核酸检测灵敏度的方法，使极低数量的目标DNA可被高灵敏度、高特异性检出。

一种提高极低拷贝数目标DNA检测灵敏度的方法，主要步骤如下：向待检测样品DNA中加入外源背景基因组DNA；使用特定的可以对目标DNA切割产生随机碱基粘性末端的限制性内切酶对混合后的样品DNA进行酶切；根据目标DNA切割后所产生的粘性末端设计与之互补的接头并与之进行连接；使用接头中含有的通用引物对连接产物进行PCR反应；以PCR产物为模板，使用针对目标DNA设计的特异性引物进行特异性核酸扩增检测。

更具体的步骤为：

a)向待检测样品DNA中加入终浓度为10-500ng/μL的外源背景基因组DNA；

b)使用可以对目标DNA切割产生随机碱基粘性末端的限制性内切酶对步骤a)得到的样品进行酶切，酶切反应参数由所选内切酶确定；

c)向酶切产物中加入针对目的基因酶切片段设计的双链DNA接头，并在DNA连接酶的作用下进行连接反应，使酶切片段的两端均连接上接头，所述接头上均带有通用引物序列，接头最终浓度为50-400nM，连接反应参数根据所选连接酶确定；