[发明专利]一种ECH1自身抗体的筛选和鉴定方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种ECH1自身抗体的筛选和鉴定方法及其应用。

背景技术

肺癌是中国，以及全球发病率及死亡率第一的恶性肿瘤。在过去的40年间，肺癌的5年生存率仅从12％上升至16％，最主要原因是诊断时已属晚期,相反，早期诊断的肺癌进行手术后生存率可提高到80％。可见，早发现、早期诊断对肺癌的治疗及预后具有重要的临床意义。当前广泛运用的检测手段包括无创检查(如X线、CT、钼靶摄片等)和有创检查(纤维支气管镜、支气管造影、B超或CT定位下穿刺活检等)，但缺乏依从性和普及运用的可能。找寻新的肺癌分子标志物，尤其是血清分子标志物，让肺癌患者能够及时有效的早查、早诊、早治，是提高肺癌患者生存率、降低死亡率的关键科学问题。尽管目前有一些肿瘤标志物,如CA125(癌抗原125)、CA19-9(癌抗原19-9)、CEA(癌胚抗原)等可用于肺癌的检测，但敏感性和特异性均不高，所以目前为止，尚没有理想的可供临床使用的肺癌早期筛查和诊断标志物。

肿瘤相关抗原(tumor-associate antigens，TAAs)的自身抗体在正常人和非肿瘤患者血清中不存在或滴度很低，而且患者血清中自身抗体水平的升高往往早于肿瘤症状的出现。再者，抗-TAA抗体具有其它肿瘤标志物不具备的优势，一方面是它能够在血清中持续稳定存在，而其它的标志物，包括TAA本身，在其被肿瘤细胞释放后就被快速降解或者在其进入血液循环后的很短时间内就被机体清除，而且，检测自身抗体检测方法和试剂的普及性也有助于研究癌症患者体内抗-TAA抗体的产生规律和功能。因此检测抗-TAAs的自身抗体可以作为早期肿瘤的血清标志物。各国学者已开展相关多项研究，值得一提的是EarlyCDT-Lung test的研究成果。EarlyCDT-Lung test是首个通过检测血清中自身抗体以检测肺癌的工具，用以辅助内科医生的物理检查方法，从而提高肺癌诊断率。最初，该实验包括六种TAAs自身抗体(p53,NY-ESO-1,CAGE,GBU4-5,Annexin I和SOX2)的检测，检测肺癌的灵敏度和特异度分别为40％和82％。新一版的EarlyCDT-Lung test将TAAs自身抗体更新至7种(p53,NY-ESO-1,CAGE,GBU4-5,SOX2,HuD和MAGE A4)，其灵敏度和特异度也分别提高到47％和90％。有研究显示，这些自身抗体结果阳性的非小细胞肺癌患者中超过一半(57％)为I期和II期的早期肺癌，提示EarlyCDT-Lung test可作为辅助CT早期检测肺癌的生物学标志物检查工具。这些研究成果提示肿瘤相关抗原抗体的检测将有望成为肺癌早期检测的重要血清学生物标志物。但值得注意的是，EarlyCDT-Lung test虽然具有较高的特异度和阳性预测值，但灵敏度仍然不够理想(不到50％)，漏诊的病例较多，导致大量患者未能被及时发现，而错失手术治疗的良机。鉴于目前自身抗体检测在肺癌诊断的临床应用中仍有不足，不断地发现和鉴定新的肺癌相关TAAs仍是一项重要的工作。

综上所述，为了最终实现降低肺癌的死亡率，提高生存率，本领域迫切需要筛选和鉴定更加敏感、特异血清学自身抗体标志物，并开发操作简单、成本低、适用范围广泛的检测肺癌自身抗体的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服肺癌现有肿瘤标志物不理想的问题，旨在提高肺癌早期诊断的灵敏度、特异度和准确性。利用一种特异性高、敏感度强的诊断标志物制备稳定性好、检测方便的用于肺癌早期诊断的试剂。提供一种在ECH1自身抗体的筛选和鉴定方法及其应用，具体设计一种能区分肺癌和正常人的抗肿瘤相关抗原ECH1(enoyl-CoA hydratase 1)自身抗体。本发明的另一目的是提供该抗肿瘤相关抗原ECH1自身抗体的ELISA检测方法。其具体技术方案为：

一种ECH1自身抗体的筛选和鉴定方法，包括以下步骤：

1)通过肺癌细胞系H1299全蛋白提取物进行双向电泳，与5例肺癌患者血清和5例正常人血清进行蛋白印迹法，筛选有意义的肿瘤自身抗原，经过比对分析，仅出现在患者血清的蛋白点被进行进一步分析；

2)SDS-PAGE胶上的兴趣蛋白点经切割、消化后，采用LC-MS/MS质谱分析方法对上述蛋白点进行分析，经检测鉴定为ECH1；