[发明专利]针对细胞或组织不同深度超分辨率显微成像的照明系统

说明书

本发明提供了一种针对细胞或组织不同深度超分辨率显微成像的照明系统，属于光学技术领域,它包括激光器，激光器产生的光束依次经过用于准直的初始透镜，再进入初始反射镜，由初始反射镜将光束传递到反射镜组，初始反射镜与反射镜组之间设有柱面镜，光束以Z轴向穿过柱面镜进入反射镜组中，穿过柱面镜后的光束截面的X、Y轴其中一个方向变焦，使光束变为薄片光束，薄片光束经反射镜组进入物镜，薄片光束能通过调节形成半全内反射照明模式。本发明解决了在对样品深层进行荧光定位显微成像时使用半全内反射或宽场照明所导致的背景光强过高使得定位过程无法进行的问题，成像深度达几个微米，且结构简单紧凑，适用于商业超分辨率荧光定位显微系统。

技术领域

本发明涉及生物显微技术领域，尤其涉及一种可对细胞或组织切片不同深度进行四色超分辨率荧光定位显微成像的照明系统。

技术背景

超分辨率荧光定位显微技术为2006年由庄小威，埃里克贝齐格(Eric Betzig)先后提出的一种可以突破光学成像分辨率极限的一种方法。埃里克贝齐格通过这项技术在2014年被授予诺贝尔化学奖。超分辨率荧光定位显微技术由其使用的荧光标记分子的种类不同可分为两种，一种是庄小威发明的随机重构光学显微技术，这种技术利用荧光染料分子(Alexa系列和Atto系列等)特异性的标记所观察样品的结构，通过荧光染料分子在特殊的缓冲液中具有的“开”“关”效应来进行超分辨率成像；另一种为埃里克贝齐格发明的使用荧光蛋白分子标记样品结构。

传统荧光显微镜的分辨率由显微镜系统的数值孔径及成像时所使用的荧光波长所限制(其中λ为荧光波长，NA为显微镜系统数值孔径)，所以无法突破200nm的分辨率极限，而荧光定位显微技术的分辨率则由分辨率极限和在一次定位过程中系统所收集到的光子数量所决定，所以收集到的光子数量越多，荧光定位显微镜的分辨率也就越高，具体数值可以达到20nm甚至更小。

为了尽可能的在一次定位过程中收集到更多的光子，人们使用了很多方法，其中比较有效也是普遍采用的方法是使用全内反射的照明方式，如附图1(c)所示，这种照明方式将照明光限制在细胞底层几百纳米的范围内，这样就可以避免细胞焦平面以外的其他荧光分子被照亮，尽可能的减小背景光，从而增加图片清晰度。这种方法在对细胞底层结构成像时可以获得很好的效果，但是在细胞或组织切片深层成像时便无能为力。对样品深层结构进行成像时往往需要使用宽场照明(附图1(a))或半全内反射照明(附图1(b))，这两种照明方法的成像结果往往背景光强度很高，影响定位精确度，有时甚至无法进行定位，所以超分辨率荧光定位显微技术在样品深层成像领域中很难实现。

图1为传统商业荧光定位显微照明系统的光路图，这种照明系统直接将由光纤((d)中1)中发出的光准直，然后聚焦在物镜6的后焦平面上，通过按图中箭头标注的方向移动光纤端点的位置，照明模式可以选择(a)宽场照明，(b)半全内反射照明，或(c)全内反射照明。这种照明系统虽然结构简单，但是具有如下的缺点：(1)第一个问题就是之前提出的这种照明方式无法对样品深层进行超分辨率荧光定位成像的问题。(2)照明光束的位置由平面镜3及二向色镜5决定，而二向色镜5通常置于商用显微镜系统的滤波片模块中，方向无法调节，所以照明光束的位置和方向完全通过平面镜3来调节，很容易使得照明光束位置不准确，装置照明效果变差；(3)对同一样品进行不同颜色的荧光定位显微成像时，需要更换光纤1中发出的激光波长，这要么通过更换光纤来实现，要么可通过将不同波长的激光器耦合到一条光纤中来实现，若使用第一种方法需要在成像过程中手动更换光纤，这不仅操作麻烦，容易破坏显微镜系统的稳定性，而且会使得实验过程变长；使用第二种方法的困难是，超分辨率荧光显微镜使用的激发光波长通常在405nm到750nm的范围内，而市场上很难找到对如此大范围激光波长均使用的光纤产品，即使可以定做这种光纤，光纤耦合器的参数也只能对某种波长的激光器进行优化，这必然使得其他波长的激光耦合效率降低，而超分辨率荧光显微成像技术要求激发光强度较高，这就只能选择功率很高的激光器，这不仅使得光纤耦合系统效率下降，而且使成本大大提升。

发明内容