[发明专利]一种维生素B12适配体亲和柱及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种维生素B12的适配体亲和柱及其制备方法和用途。属食品检测领域。

背景技术

维生素B12是唯一一类含有主要矿物质钴的维生素，故又名钴胺素，包括氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺。通常狭义上所指维生素B12是氰钴胺，它是食品和营养补充剂中B12的主要形式。B12易溶于水，在吸收时需要与钙结合，大部分为小肠所吸收，人体只能利用甲钴胺和腺苷钴胺，因此氰钴胺要在体内细胞转化成这两种形式才能被人体吸收利用。

婴幼儿缺乏维生素B12表现为精神情绪异常、表情呆滞、反应迟钝等，最后导致贫血。婴幼儿过量摄入维生素B12则易导致叶酸缺乏，有些会出现哮喘、湿疹、荨麻疹、面部水肿等过敏性症状。因此我国标准对婴幼儿品配方乳粉中B12的添加量有严格的规定，其中GB 14880—2012 《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中儿童调制乳粉中B12的添加量为10 ～ 30μg /kg，相关产品国标标准添加限量也在此范围。目前市售婴幼儿乳粉是营养标签中B12的含量大部分在1. 5 ～ 2. 5μg /100g 之间。

目前食品中维生素的测定方法较多,包括微生物法、比色法、示波法、原子吸收法、高效液相色谱法等。其中微生物分析法灵敏度高,但培养时间长、操作繁琐等缺点，大部分的检验机构不能较好地开展。,原子吸收法受基质钻元素的影响可使结果不准确。

高效液相色谱法( HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点,目前也被常用于食品中维生素的检测。但因其对样品中维生素纯度的要求较高,导致检测成本高、周期长,无法满足大批量样品快速筛选的需要,所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱（IAC-HPLC)）将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术,在维生素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时,其中的抗原与抗体结合,其他杂质则通过水溶液洗掉,再用有机溶剂将抗原即维生素洗脱下来,从而使样品中的维生素得以净化。O.Heudi等使用免疫吸附柱纯化，通过高效液相紫外成功地检测出维生素B12。

免疫亲和柱具有操作简单，特异性高的优点。但是由于抗体获得困难，免疫亲和柱通常比较昂贵。并且由于抗体本身是一种蛋白质，其活性受到周围环境的影响。保存不当或者操作不当很容易造成抗体失活从而影响免疫亲和柱的效率。

适配体是一段核酸序列，通常为DNA或者RNA序列。 单链的核酸序列可以形成二级结构，从而能与靶点特异性结合。通过多次的富集和筛选，能够筛选到与靶点有高亲和力的特异性适配体。Herman等描述了核酸适配体的结合特异性，[Science 287,820-825].核酸适配体相对于抗体来说更稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。

核酸适配体被应用于小分子的检测，在专利CN105505940A中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体DNA传感器。通过黄曲霉毒素B1的适配体，及多条互补探针序列制备DNA传感器，通过酶底物反应，实现黄曲霉毒素B1的检测。在专利CN105400790A中，描述了一种黄曲霉毒素的检测方法。利用黄曲霉毒素B1的适配体与蔗糖酶结合，通过酶与糖底物的相互作用，依靠血糖仪实现黄曲霉毒素B1的检测。上述都是利用黄曲霉毒素适配体实现毒素的检测。

在毒素分离中，专利CN 104651369A中描述了一种黄曲霉毒素磁性分离方法，将黄曲霉毒素B1核酸适配体序列与磁珠结合，实现分离。在专利CN104399283中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体亲和柱。该专利利用环氧基活化的琼脂糖微球，将黄曲霉毒素B1的适配体偶联，制备成亲和柱。实现黄曲霉毒素的分离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种维生素B12适配体亲和柱及其制备方法和用途

在本发明中，我们利用SELEX系统，从适配体文库中筛选出来一条高特异性、高亲和力的的新的维生素B12的RNA适配体。适配体修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺活化的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到维生素B12的特异性载体。载体装柱后就形成了高亲和力的维生素B12适配体亲和柱

该亲和柱操作简便，纯化维生素B12效率高。能耐受有机溶剂，并且可以重复使用。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的维生素B12。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。

具体操作如下：