[发明专利]基于位点特异性重组的四膜虫表达载体及其构建和应用有效
| 申请号： | 201710217711.8 | 申请日： | 2017-04-05 |
| 公开（公告）号： | CN107012146B | 公开（公告）日： | 2020-02-14 |
| 发明（设计）人： | 许静;王伟;薄涛;杨焕 | 申请（专利权）人： | 山西大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C07K1/14;G01N33/68 |
| 代理公司： | 14105 山西五维专利事务所(有限公司) | 代理人： | 张福增 |
| 地址： | 030006 山*** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 多克隆酶切位点 表达载体 构建 限制性内切酶酶切位点 位点特异性重组 蛋白相互作用 免疫荧光定位 突变细胞株 自身启动子 侧翼序列 抗性筛选 酶切位点 模块合成 目的基因 内源基因 亲和纯化 融合标签 转录终止 编码区 构建体 灵敏度 同源臂 可用 扩增 酶切 质粒 串联 蛋白 克隆 消化 上游 调控 转化 应用 研究 | ||
1.一种表达载体pNeo4-3HA，含有核苷酸序列为SEQ ID NO：1的3HA-motif；所述3HA-motif通过以下步骤设计合成：在Sac1和Not1酶切位点之间加入18个随机碱基；之后，在Not1后加一个A碱基，紧跟其后为3个优化密码子的HA序列和TGA三联体密码子；每两个HA序列之间加三个碱基做linker；之后在酶切位点Sal1和Pst1之间是嗜热四膜虫ACTIN1基因的3'-UTR和转录终止子序列。
2.如权利要求1所述的表达载体pNeo4-3HA的构建方法，包括如下步骤：
(1)设计并合成3HA-motif：在Sac1和Not1酶切位点之间加入18个随机碱基；之后，在Not1后加一个A碱基，紧跟其后为3个优化密码子的HA序列和TGA三联体密码子；每两个HA序列之间加三个碱基做linker；之后在酶切位点Sal1和Pst1之间是嗜热四膜虫ACTIN1基因的3 '-UTR和转录终止子序列；
(2)将3HA-motif克隆到pUC18-T载体上，获得质粒pUC18-3HA，酶切、测序鉴定正确；
(3)将质粒pUC18-3HA和载体pNeo4分别通过Sac1和Pst1消化后，将3HA-motif经连接插入到载体pNeo4的5 '多克隆酶切位点中，从而获得了特异性位点重组表达载体pNeo4-3HA。
3.如权利要求1所述的表达载体pNeo4-3HA在基因自身启动子调控下的表达、定位、蛋白纯化和蛋白相互作用分析中的应用。
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