[发明专利]基于位点特异性重组的四膜虫表达载体及其构建和应用

说明书

本发明公布了一种基于位点特异性重组的四膜虫表达载体及其构建和应用。该载体以质粒pNeo4为骨架，组合串联的HA标签序列、限制性内切酶酶切位点及四膜虫ACTIN1基因的转录终止序列为模块，将模块合成、酶切位点消化插入到pNeo4的5'端多克隆酶切位点中，构建出表达载体pNeo4‑3HA。使用该载体时，分别扩增获得重组同源臂—目的基因编码区C端序列及其3'侧翼序列，经酶切连接克隆到pNeo4‑3HA载体的5'上游和3'下游多克隆酶切位点中。得到的构建体经转化四膜虫、抗性筛选获得表达突变细胞株。本载体实现了在自身启动子调控下C端表达融合标签的内源基因的目的，操作简单快捷，3个HA标签提高了免疫荧光定位灵敏度，还可用于蛋白亲和纯化和蛋白相互作用研究。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种含串联的3个HA标签的位点特异性重组表达载体pNeo4-3HA及其构建方法和应用。

背景技术

目的蛋白融合标签的表达载体广泛地应用于蛋白定位、相互作用和功能研究中。在模式生物—纤毛类嗜热四膜虫中，融合标签可以通过同源重组的方式有效地重组到内源基因位点上，所以融合标签的蛋白表达载体在四膜虫中是一种极其有用的分子工具(Cassidy-Hanley et al,1997)。但目前能使用的该类构建载体还很少。现在已有的目的基因融合标签的构建体的构建方式可分为两种：一种方法是构建内源基因启动子调控下的目的基因融合标签的表达构建体。该方法可以在目的基因自身启动子调控下将目的基因融合标签一起表达出来，可以得到内源基因在细胞中的真实定位模式。但目前获得该类构建体的方法或者是通过使用多次重叠PCR和巢式PCR的方法得到构建体(Xu et al,2012)，或者是使用重叠PCR与多个载体的酶切、连接的方法获得构建体(Kataoka et al,2010)。这些方法在构建重组质粒时过程复杂，往往需要使用多对引物和较长的重叠PCR引物，导致经济成本上升并因此无法增加较多的标签数目，从而可能由于许多目的基因在自身启动子调控下表达的水平不高而标签数目又少，使其抗体亲和量较少，最终导致无法获得清晰的定位信号；另一种方法是构建目的基因的过表达构建体，该构建体可使目的基因在金属离子Cd²⁺诱导下，在MTT1的启动子调控下过量表达，从而借以观察目的基因在四膜虫细胞中的定位模式(Shang et al,2002；Zweifel et al,2009)，该构建方法简单，易于操作，通过过量表达目的基因能将表达量低的目的基因的定位信号的清晰度提高，发现定位细节，但也可能由于基因的过量表达而造成细胞发育受阻或出现非特异性定位。

为实现既能简便经济地获得在目的基因自身启动子调控下的内源基因融合标签表达构建体，又能将标签序列增加以提高目的基因的定位信号清晰度，本发明构建了一种基于特异性位点重组的目的基因C端含3HA标签的内源基因表达载体，pNeo4-3HA。该载体是利用敲除载体pNeo4为构建骨架(Mochizuki,2008)，在其5'端的多克隆酶切位点的Sac1和Pst1之间将模块(3HA-motif)插入其中构建而成。动力蛋白基因ACTIN1的3'-UTR及转录终止子为融合3HA标签的目的基因的转录提供终止信号。该表达载体可用于目的蛋白的细胞定位、纯化和蛋白相互作用分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含串联的3个HA标签的基于位点特异性重组的表达载体pNeo4-3HA及其构建方法；以及该表达载体pNeo4-3HA在基因自身启动子调控下的表达、定位、蛋白纯化和蛋白相互作用分析中的应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种3HA-motif，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

一种表达载体pNeo4-3HA，含有如权利要求1所述的3HA-motif。

一种表达载体pNeo4-3HA的构建方法，包括以下步骤：