[发明专利]寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法

权利要求书

1.寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法，该方法是利用primer3引物批量设计程序实施的，其特征在于：

所述SSR位点的侧翼序列长度不小于50bp；

程序的输入参数中：退火温度为55～65℃；上、下游引物的Tm值相差不超过2℃；PCR产物大小为80～300bp；引物长度为18～28bp；GC含量为40～60％。

2.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：对从primer3引物批量设计程序中获得的引物对，在寒兰Unigene库中进行Blast验证。

3.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：对从primer3引物批量设计程序中获得的引物对，通过以下PCR扩增步骤验证其有效性：

PCR反应体系为：每25μL PCR反应体系中含5units/μL的Taq DNA聚合酶0.125μL，不含Mg²⁺的10×buffer 2.5μL，25mM的MgCl₂ 1.5μL，dNTP Mixture 2μL，10μM的引物1μL，DNA模板50ng，ddH₂O定容至25μL；

PCR反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，34个循环；最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求3所述的引物设计方法，其特征在于所述dNTP Mixture中dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度均为2.5mM。

5.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于所述含有SSR位点的基因片段是使用位点挖掘程序MISA从寒兰Unigene库中进行SSR位点搜索得到的。

6.根据权利要求5所述的引物设计方法，其特征在于所述SSR位点搜索的过程中，向程序输入的搜索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为6、6、4、3、3和3次。