[发明专利]一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法

权利要求书

1.一种不含蛋白和血清的细胞冻存液，其特征在于，所述不含蛋白和血清的细胞冻存液包括以下质量分数或体积分数的组分：

质量分数为1％-3％的聚乙烯醇、质量分数为2.5-3.5％的葡萄糖、质量分数为0.15-0.20％的氯化钠、质量分数为0.005-0.008％的磷酸二氢钠、质量分数为0.03-0.06％的磷酸氢二钠、质量分数为0.04-0.06％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量分数0.002-0.005％的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、体积分数为5％-12％的二甲基亚砜；其余为双蒸水。

2.根据权利要求1所述不含蛋白和血清的细胞冻存液，其特征在于，所述不含蛋白和血清的细胞冻存液包括以下质量分数或体积分数的组分：

质量分数为1.5％-2.5％的聚乙烯醇、质量分数为2.8-3.2％的葡萄糖、质量分数为0.18-0.20％的氯化钠、质量分数为0.006-0.008％的磷酸二氢钠、质量分数为0.035-0.055％的磷酸氢二钠、质量分数为0.04-0.06％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量分数0.002-0.005％的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、体积分数为7％-10％的二甲基亚砜；其余为双蒸水。

3.根据权利要求1或者2所述不含蛋白和血清的细胞冻存液，其特征在于，所述聚乙烯醇的分子量为40000-60000。

4.权利要求1所述不含蛋白和血清的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；

(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液。

5.根据权利要求4所述不含蛋白和血清的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，所述过滤为将所述混合液依次用0.45um滤膜、0.22um滤膜过滤。

6.权利要求1所述不含蛋白和血清的细胞冻存液在保存细胞中的应用。

7.一种冻存细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；

(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液；

(3)将细胞悬浮液置于离心管中，离心处理后弃上清、收集培养细胞沉淀；然后加入细胞冻存液，制成细胞混合液；然后将细胞混合液置入-80℃，完成细胞冻存。

8.根据权利要求7所述冻存细胞的方法，其特征在于，所述过滤为将所述混合液依次用0.45um滤膜、0.22um滤膜过滤；所述离心处理为1000rmp处理5分钟；将细胞混合液分装于已标记的冻存管中，然后置入-80℃，完成细胞冻存。

9.根据权利要求7所述冻存细胞的方法，其特征在于，所述细胞混合液中，细胞浓度为5×10⁵-1×10⁷/mL。

10.一种细胞冻存复苏的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；

(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液；

(3)将细胞悬浮液置于离心管中，离心处理后弃上清、收集培养细胞沉淀；然后加入细胞冻存液，制成细胞混合液；然后将细胞混合液置入-80℃，完成细胞冻存；

(4)取出冻存的细胞，放入37℃水浴槽中解冻；待细胞混合液完全融化后，加入细胞培养基；然后于1000rmp离心处理5分钟，收集冻存细胞沉淀，移去上清液；再加入新鲜细胞培养基，完成细胞复苏。