[发明专利]检测22个位点耳聋基因多态性的SNaPshot试剂的应用

权利要求书

1.引物组在制备检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂中的应用，引物具体序列为：

管1的扩增引物：

管2的扩增引物：

管1的测序引物：

管2的测序引物：

2.权利要求1所述的应用，其中测序引物浓度比例如下：

管1各测序引物的浓度:

管2各测序引物的浓度:

3.权利要求1或2任一项所述的试剂盒,其中扩增引物在进行扩增时，扩增试剂比例如下：

其中，扩增引物的比例均为1：1。

4.权利要求1或2任一项所述的试剂盒，扩增产物在进行微测序时，测序试剂比例如下：

5.一种利用Snapshot技术一次性检测多个耳聋基因多态性位点的非诊断科研方法，具体包括步骤：

DNA提取：

以人血的采集样本进行DNA提供，具体参考公司有关《血液基因组DNA提取标准操作流程》，提取完毕的DNA计算其浓度并稀释至5-10μg/mL；

试剂准备：

a)配置二倍的Master Mix，这其中包括dNTP、MgCl₂、热启动超保真DNA聚合酶、缓冲液，室温融化后，短暂离心；准备好合适数量的PCR反应管；

b)配制权利要求1所列的扩增引物混合物：各引物的比例均为＝1:1，震荡混匀；短暂离心后备用；

c)反应体系配制

d)震荡混匀，短暂离心后，分装23μL至标记好的PCR反应管。转移至标本制备区；

加样

a)若样品及质控品保存在-20℃，使用前置室温解冻，并短暂离心；

b)向分装好的PCR反应管中加入10ngDNA模板，并进行稀释；

c)盖好管盖后，震荡混匀，短暂离心，转移至PCR扩增区；

PCR扩增：

置PCR管放于PCR仪上。反应程序设置如下：

95℃5min；95℃30s；55℃30s；72℃1min；45个循环；72℃5min；25℃保温；

PCR扩增产物纯化：

取2ul的ExoSAP-IT分装到200ul EP管，每管加入PCR产物5ul，混匀微离，按以下程序进行PCR：7ul 37℃15min；80℃15min；4℃forever

SNaPshot PCR扩增

a)反应结束后取出8连管，配制权利要求1所列的测序引物混合物，比例如下：

b)按以下体系配置：

试剂 体积(μL) SNaPshot Ready Mix 1.25 ddH₂O 4.25 5倍稀释的测序缓冲液1.5 引物混合物 2 total 9.0

c)对纯化后2管的扩增产物分别进行Snapshot延伸，加入1ul纯化产物，混匀微离，按以下程序进行PCR：96℃10s；96℃10s；50℃5s；60℃30s；25个循环；4℃保温；

SNE产物纯化：

a)往SNaPshot PCR产物中加入FastAP 1ul、buffer2 ul、7ul水、10ulSNaPshot PCR产物，按以下程序进行PCR：

b)37℃10min；75℃5min；1个循环；4℃保温；

电泳：

SAP处理完的产物1ul+8.8ul HiDi+0.2ul 120 Liz 95℃变性3min，冰上冷却，上机结果分析与解释：

分析采用GENEMAPPERID V4.1软件进行初步分析，确定SNP位点；

分析完毕的结果需要保存，GENEMAPPERID V4.1软件文件格式及SNaPshot峰图各保存一份；

GeneMapper4.1软件分析。