[发明专利]检测22个位点耳聋基因多态性的SNaPshot试剂的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学诊断领域和遗传病领域。具体地，本发明提供了一种检测多种耳聋基因多态性的SNaPshot试剂盒。

背景技术

先天性耳聋是最常见的出生缺陷之一，也是最常见的人类感觉系统疾病，发病率为 0.1％-0.3％。60％的耳聋与遗传因素相关。在这些遗传因素中，主要包括GJB2、SLC26A4、GJB3 基因和线粒体DNAm.1555A>G和m.1494C>T位点。在中国新生儿耳聋基因突变筛查中，GJB2 基因突变具有较高的携带率，约2.6％，SLC26A4基因突变携带率约为1.9％，新生儿线粒体 DNA m.1555A>G均质突变占0.1％，GJB3基因突变仅在少数患者中发现。

GJB2基因编码的Cx26表达于耳蜗，位于内耳血管纹、基底膜和螺旋缘，与先天性遗传性中重度耳聋相关，GJB2基因突变后，K+进入内淋巴液的循环受到影响，导致常显或常隐感音神经性耳聋(DFNB1或DFNA3)。

GJB3基因编码的Cx31是缝隙连接蛋白的一员，在耳蜗和听神经内表达，突变可导致常显或常隐非综合性耳聋、周围神经疾病伴听力丧失。

SLC26A4基因主要引起中国人大前庭水管综合征，可结合颞骨CT进行检测。此病出生时听力可能正常，或有轻度至中重度的听力损失，因堕床、儿童玩耍或体育活动中的轻度碰撞或感冒可以造成明显的听力下降，其临床表现与发病年龄、耳聋程度以及是否伴有眩晕有密切的关系。

线粒体DNA突变为母系遗传，线粒体DNA m.1494C＞T、m.1555A＞G与氨基糖甙类药物致聋和非综合征型耳聋有关。

中国不同地区的非综合征型耳聋患者中，各基因的突变比例有所差异，主要突变基因为 GJB2基因，SLC26A4基因和线粒体DNA m.1555A>G和m.1494C>T位点，GJB3基因突变仅在少数患者中发现，GJB2基因主要突变方式为c.235delC，约占GJB2基因突变的63.6-76.8％，其次是c.299_300delAT和c.176_191del16约占8.7％-13.1％，c.508_511dupAACG约占 4.3％-6.3％。SLC26A4基因的主要突变为c.2168A>G和c.919-2A>G，约占SLC26A4基因突变的77.1％-84.67％，c.1975G>C和c.2162C>T等分别约占1％-2.5％。线粒体DNA耳聋基因主要突变为m.1555A>G，m.1494C>T。

由于其他测序检测方法多存在准确度，特异性，精密度不足的问题，目前的耳聋基因多态性检测一般仍然采用sanger法进行，其一次实验中仅能检测一个位点，而且花费时间较长。这种困难造成的耳聋基因多态性检测，特别是能覆盖广泛耳聋基因多态性位点的筛查难以普及，即使在北京，上海等城市，新生儿免费耳聋基因筛选也仅覆盖两个GJB2和SLC26A4 位点，需要自费数百元的进一步筛查也仅多4个位点，这样的筛查无疑会遗漏大量潜在的遗传性耳聋患者，对其今后的保健和治疗带来不利影响。此外，上述检测手段的局限也使得遗传病相关科研工作难以大规模开展。

Snapshot通过为不同位点设计不同长度的引物进行Snapshot反应，产物经电泳分离，荧光检测，Gene mapper分析，可一次性检测多个SNP位点，而且每次反应中仅需极少量DNA 样本。比一般PCR方法复杂的是，Snapshot检测体系，特别是多重Snapshot检测体系设计中需要考虑的因素众多：引物长度，Tm值，尾部结构选择，以及模板和引物的比例都可能造成非特异性扩增和随后的碱基误读。设计可靠的多重Snapshot检测体系需要对引物设计进行缜密考虑，大量验证并进行相应调整。