[发明专利]一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法

权利要求书

1.一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法，其特征在于：在接头制作的接头引物P7上引入能够阻止聚合酶延伸的Spacer修饰；在接头延伸步骤，DNA聚合酶遇到P7模板链的Spacer位点后即终止延伸，留下一段5’突出末端；接下来的酶切步骤，内切酶去除包括Spacer位点在内的突出末端，产生完整的接头；而酶切不充分残留的未被酶切接头，仍然保留5’突出末端，

其中，所述的P7包括接头引物P7-A、P7-B和P7-C，接头引物P7-A为FFFFF-Spacer-EEEEEJJJJJNNNNNNNNNNNN连接在SEQ ID NO：2的5’端所得；接头引物P7-B为FFFFF-Spacer-EEEEEKKKKKNNNNNNNNNNNN连接在SEQ ID NO：2的5’端所得；接头引物P7-C为FFFFF-Spacer-EEEEELLLLLNNNNNNNNNNNN连接在SEQ ID NO：2的5’端所得。

2.如权利要求1所述的一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法，其特征在于：Spacer修饰的种类包括dSpacer，C3Spacer，C6Spacer，C12Spacer，Spacer 9或Spacer 18中的至少一种。

3.如权利要求1所述的一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法，其特征在于：Spacer修饰的个数为1个-5个；2个以上的Spacer跟第一个Spacer串联，或分布于突出末端序列中。

4.如权利要求1所述的一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法，其特征在于：随机标签接头包括随机标签接头A、随机标签接头B和随机标签接头C，随机标签接头A、随机标签接头B和随机标签接头C分别由接头引物P5分别与Spacer修饰的接头引物P7-A、接头引物P7-B和接头引物P7-C合成而得到，其中：

接头引物P5为SEQ ID NO：1：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

接头引物P7-A为FFFFF-Spacer-EEEEEJJJJJNNNNNNNNNNNN连接在SEQ ID NO：02的5’端所得；SEQ ID NO：2：AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

接头引物P7-B为FFFFF-Spacer-EEEEEKKKKKNNNNNNNNNNNN连接在SEQ ID NO：02的5’端所得；

接头引物P7-C为FFFFF-Spacer-EEEEELLLLLNNNNNNNNNNNN连接在SEQ ID NO：02的5’端所得；

所述FFFFF为突出末端序列，Spacer为Spacer修饰位点，EEEEE为酶切位点，JJJJJ、KKKKK和LLLLL为定位标签序列且JJJJJ、KKKKK和LLLLL各不相同，NNNNNNNNNNNN为随机分子标签序列；

其中：

FFFFF序列为非人源基因组的其它碱基序列，长度需大于5个碱基；

Spacer修饰位点为Spacer修饰的碱基或碱基之间的Spacer链；Spacer修饰的个数为1-5；2个以上的Spacer跟第一个Spacer串联，或分布于突出末端序列FFFFF中，Spacer分布于突出末端序列中可以避免该序列可能带来的污染；

JJJJJ、KKKKK、LLLLL和EEEEE包括但不限于5个相同碱基，NNNNNNNNNNNN为4到12个随机碱基，且没有四个连续相同的碱基。

5.如权利要求1所述的一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法，其特征在于：FFFFF序列为非人源基因组的其它碱基序列，长度为5-20个碱基。

6.如权利要求4所述一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法，其特征在于：所述NNNNNNNNNNNN表示为BDHVBDHV，其中B表示该位置是除A外的碱基，D位置表示该位置是除C外的碱基，H表示该位置是除G外的碱基，V表示该位置是除T外的碱基。

7.如权利要求4一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法，其特征在于：所述JJJJJ、KKKKK和LLLLL的序列可以和所述EEEEE的序列部分重叠或完全重叠，当部分或完全重叠的时候，重叠部分的碱基只出现一次。