[发明专利]一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法

说明书

本发明公开了一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法，其特征在于：在接头制作的接头引物P7上引入能够阻止聚合酶延伸的Spacer修饰；在接头延伸步骤，聚合酶遇到P7模板链的Spacer位点后即终止延伸，留下一段5’突出末端；接下来的酶切步骤，内切酶去除包括Spacer位点在内的突出末端，产生完整的接头；而酶切不充分残留的未被酶切接头，仍然保留较长5’突出末端。

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，具体涉及一种用于改进的二代测序用随机标签接头的工艺优化。

背景技术

随着技术的成熟以及成本的降低，二代测序因其测序通量上的优势，在科研以及临床转化领域正在逐渐取代传统的一代测序以及常规的PCR分子检测方法。

二代测序应用于临床目前还面临许多问题与挑战，其中一个突出问题就是测序较高的错误率。目前应用较广的二代测序平台主要有Illumina平台(HiSeq、MiSeq、NextSeq等)和Life的Ion Torrent平台(PGM和Proton及衍生系列)，两类二代测序的的测序错误率还较高(Illumina平台0.1％，Ion Torrent平台1％)。

对于以肿瘤细胞突变为代表的体细胞突变(somatic mutation)检测来讲，由于肿瘤细胞之间的异质性，肿瘤样本中突变位点的比例可能非常低(1％)；而在液态活检中，肿瘤游离DNA的突变率甚至低于0.1％。由于较高的测序错误率背景，常规的二代测序平台无法检测出这些突变。目前主要通过分子标签(UMI unique mouecule identifier)的方法来克服这一问题。

分子标签是一小段DNA片段，可以是固定序列的组合，也可以是随机序列，在测序前的文库制备阶段，通过给每一条原始DNA模板上引入分子标签标记，来达到区分DNA模板的目的；在后续的生物信息学分析阶段，通过分子标签的识别，就可以利用文库构建过程中产生的重复序列(duplication)来实现测序碱基的校正的目的。

分子标签技术主要包括PCR法和随机标签接头法，随机标签接头法由于更低的错误率(10^-8)及更好的文库构建兼容性，应用更为广泛。

但随机标签接头由于其制作工艺的原因，最终制作的接头会有部分酶切不完整的平末端接头，这部分平末端接头的存在，会导致测序文库模板的丢失以及测序数据量的浪费(图1、图2)。而通过生物素标记接头制备的引物oligo方法虽然可以去除平末端接头，但该方法会增加接头的制备步骤，且亲和素磁珠纯化过程中由于操作不当，容易造成双链接头的解链，导致接头的部分失效。

因此，如何有效地去除随机标签接头中的平末端接头仍然是一个亟待需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种随机标签接头制备的优化工艺。

其特征在于，在接头制作的接头引物P7上引入Spacer修饰，修饰的种类包括但不限于C6Spacer、Spacer 18、dSpacer等可以阻止聚合酶延伸的核酸修饰(图3)。在接头延伸步骤(图4)，聚合酶遇到P7模板链的Spacer位点后即终止延伸，留下一段5’突出末端；接下来的酶切步骤，内切酶去除包括Spacer位点在内的突出末端，产生完整的接头；而酶切不充分残留的未被酶切接头，仍然保留较长5’突出末端。

在文库的构建过程中(图5)，正常的接头通过末端的T碱基和模板DNA末端的A碱基连接，形成完整的文库；未酶切接头因为带有较长的突出的5’末端，无法和带A尾的DNA模板发生连接，不影响文库的构建。

随机标签接头由随机标签接头A、随机标签接头B和随机标签接头C组成，随机标签接头A、随机标签接头B和随机标签接头C分别由接头引物P5分别与Spacer修饰的接头引物P7-A、接头引物P7-B和接头引物P7-C合成而得到，其中：

接头引物P5为SEQ ID NO：01