[发明专利]一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法

权利要求书

1.一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)、用组织DNA提取试剂盒对患者脑胶质瘤的组织提取DNA，确保DNA浓度不低于50ng/ul，260/280＝1.8；

(2)、取20ul DNA，用甲基化修饰试剂盒对提取DNA进行硫化处理；

(3)、用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物对已经硫化修饰后的DNA位模板进行降落PCR，其中反应体系为25uL，其包括：模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL；

(4)、利用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物PCR扩增的产物稀释1000倍位模板，再以SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增，其中反应体系为25uL，其包括:模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO 4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL；

(5)、将SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳；

(6)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；

(7)、PCR产物的与T载体的连接转化及蓝白斑筛选：

(7.1)、插入的目的基因片断与载体的摩尔数比为3～8:1，反应体系如下：

混匀反应体系，整个反应体系置于22℃连接30min；

(7.2)、转化大肠杆菌：

在100μL的感受态细胞中加入10μL连接的产物，冰浴30min，将此混合物置于42℃水浴准确热激90s，迅速将反应物冰浴3min，加入400μL新鲜的LB液体培养基，于37℃，120rpm摇床温育60min，培养液悬浮细胞，全部涂布于LB/Ampicillin平板上，水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养12～16h，直至出现单菌落，将培养皿置于4℃冰箱放置数小时，使其充分显色，即出现蓝、白斑，其中蓝色菌落为空载体，白色菌落即为含有外源基因片断的重组子；

(8)、菌落PCR进行重组子的筛选：

用接菌环挑取白色单菌落于1mL LB/Ampicillin液体培养基中，37℃，250r/min振荡培养3h，肉眼观察浑浊，取1μL菌液作为为模板，按照步骤(4)的PCR反应体系和条件进行菌落PCR扩增，PCR扩增产物1％琼脂糖电泳，紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆；

(9)、将阳性的克隆送到测序；

(10)、将测序结果用biq-analyzer软件分析，得到甲基化结果。

2.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃至42℃退火30s每度2个cycle，最后再42℃退火30s 10个cycles，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。

3.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，其特征在于：所述的步骤(8)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存，反应体系为25uL体系，其包括:模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO 4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL。

5.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)-(5)中，所述的特异性扩增的引物SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3和SEQ NO 4，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：GTTTAGYGAGGATGYGTAGATTGTT

SEQ NO 2：AAAAAAAACTAAACAACACCTAA

SEQ NO:3：TTTTTTTYGGGTTTYGTTTTAGTTT

SEQ NO:4：ACTCRCCCRAAATAAATAAAAATCA。