[发明专利]一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体来说是一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法。

背景技术

DNA甲基化是一种基因组DNA表观遗传修饰的主要形式和基因组功能调节的重要手段。DNA甲基化修饰的方式有很多，被修饰位点的碱基可以是腺嘌呤N-6位、胞嘧啶的N-4位，也可以是鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位。DNA甲基化具体是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基基团。最近研究表明DNA甲基化在基因突变、表达调控、细胞增殖、分化、发育过程中发挥重要的作用，并且与肿瘤发生发展有密切关系。

通过调整DNA修饰机制来提高常规化疗药物疗效是肿瘤研究的一个重要领域,O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在修饰O6-烷基鸟嘌呤损伤中的特殊作用机制及自杀性酶特性，使其在肿瘤早期诊断和预测肿瘤对烷化剂敏感性中具备重要意义。

MGMT基因结构功能的异常，特别是启动子过甲基化和肿瘤发生以及生物学上的联系，正成为关注的焦点,启动子区过甲基化是引起基因沉默的主要机制之一，可能影响基因功能的正常发挥,大量研究表明，MGMT基因甲基化与替莫唑胺(TMZ)疗效相关，MGMT基因启动子甲基化患者组生存时间明显长于非甲基化组。

目前甲基化的检测方法很多，如甲基化敏感的限制性内切酶-PCR/Southern法、直接测序法、甲基化特异性PCR(MSP)-电泳等,MGMT基因甲基化检测最常用的是MSP，该方法操作方便、适用性广，灵敏度约为10％,直接测序法的灵敏度低，要求受检材料的突变比例大于20％，且检测成本高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的检测精确度差、操作不便的缺陷，而提供一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法。

本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，具体步骤如下：

(1)、用组织DNA提取试剂盒对患者脑胶质瘤的组织提取DNA，确保DNA浓度不低于50ng/ul，260/280＝1.8；

(2)、取20ul DNA，用甲基化修饰试剂盒对提取DNA进行硫化处理；

(3)、用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物对已经硫化修饰后的DNA位模板进行降落PCR，其中反应体系为25uL，其包括：模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL；

(4)、利用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物PCR扩增的产物稀释1000倍位模板，再以SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增，其中反应体系为25uL，其包括:模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO 4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL；

(5)、将SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳；

(6)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；

(7)、PCR产物的与T载体的连接转化及蓝白斑筛选：

(7.1)、插入的目的基因片断与载体的摩尔数比为3～8:1，反应体系如下：

混匀反应体系，整个反应体系置于22℃连接30min；

(7.2)、转化大肠杆菌：

在100μL的感受态细胞中加入10μL连接的产物，冰浴30min，将此混合物置于42℃水浴准确热激90s，迅速将反应物冰浴3min，加入400μL新鲜的LB液体培养基，于37℃，120rpm摇床温育60min，培养液悬浮细胞，全部涂布于LB/Ampicillin平板上，水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养12～16h，直至出现单菌落，将培养皿置于4℃冰箱放置数小时，使其充分显色，即出现蓝、白斑，其中蓝色菌落为空载体，白色菌落即为含有外源基因片断的重组子；

(8)、菌落PCR进行重组子的筛选：