[发明专利]一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法

说明书

本发明公开了一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，该方法通过模拟反硝化聚磷菌的生存环境，设计了厌氧‑缺氧两相交替条件，分别在厌氧相采用含外加碳源无磷培养基和缺氧相采用无外加碳源含磷培养基进行筛选，接着将驯化培养液稀释后涂布筛选出单株菌，然后将筛选出的单株菌分别点种在含5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚基磷酸酯高、低磷固体培养基上，挑选在上述两种培养基中同时出现蓝斑的菌株，将其在BTB反硝化培养基中划线培养，挑选使培养基变蓝的菌株。本发明具有选择性强、工作量小、能大大缩短筛选周期等优点。

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种高效、快速的两相法筛选反硝化聚磷菌方法。

背景技术

在我国的水体污染问题中，水体富营养化污染尤为严重，而氮、磷污染物是导致众多水体富营养化的主要因素。每年有接近600亿吨携带着大量的氮和磷的废水进入水体，造成水体富营养化，进而引起水环境藻类大量繁殖，消耗水中的溶解氧，影响水中生物的生长。所以开发高效经济的污染水体脱氮除磷技术具有重要意义。

硝化菌与传统聚磷菌的菌龄不同，反硝化菌与聚磷菌存在碳源上的竞争，使得传统的生物脱氮除磷处理过程存在着很大矛盾，而反硝化聚磷菌(Denitrif yingPhosphorus Accumulating Organisms，DPAOs)能解决这一矛盾。它能在厌氧-缺氧交替的环境下实现厌氧释磷，缺氧条件下，以硝酸盐作为电子受体，通过DPAOs代谢同时完成反硝化与过量吸磷的过程，解决碳源利用和泥龄差异问题。该过程比传统工艺节省50％的COD和30％的耗氧量。

目前国内外对DPAOs的种类、除磷机理及影响DPAOs的脱氮除磷效果的主要因素有了一定的研究，在DPAOs的富集筛选方法上也有了一定的积累，但是筛选过程都存在工作量比较大、耗时较长等缺点。目前比较常规的筛选方法是在模拟SBR反应器中先进行富集，然后在通过固体培养基进行分离纯化，筛得单菌落再进行除磷效果试验、反硝化产气试验或在BTB(含溴百里酚蓝)固体反硝化培养基中鉴定反硝化能力。该方法的富集过程需要1-2个月时间，并且外加碳源的加入使杂菌滋生，消耗了外加碳源，降低了筛菌的针对性，使得筛菌的效率大大降低。

碱性磷酸酯酶是一种单酯磷酸水解酶，能催化磷酸单酯水解生成无机磷酸盐和相应的醇或酚，是参与细胞磷代谢的主要酶类。现有的研究表明，在磷含量较低的条件下，聚磷菌的碱性磷酸酯酶的表达不受抑制，菌株可以将5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯水解成蓝色的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯二聚体微粒，使菌株细胞被染成蓝色。但在磷含量较高的条件下，菌株的碱性磷酸酯酶的表达受抑制，菌株不被染色。然而，如果菌株的phoU基因发生突变，即使在高磷含量的条件下，碱性磷酸酯酶的表达也不再受到高磷浓度的限制，菌株可以把5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯水解成蓝色的5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯二聚体微粒，使得细胞被染成蓝色。故可以利用菌株能够在低、高磷含量的条件下均能使5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯水解而自身变蓝的原理来筛选出具有高效聚磷功能的菌株。

本发明根据DPAOs的生长特点，采用两相法快速筛菌，交替模拟厌氧-缺氧条件，分别选用不同的培养基，大大缩短了菌株富集时间，采用含5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯的固体培养基进行具有高效聚磷能力的菌株筛选，并用BTB反硝化固体培养基筛选出反硝化聚磷菌，最终大大缩短了筛菌时间。

发明内容

本发明的目的在于克服现有反硝化聚磷菌富集筛选方法存在的工作量大、耗时长等不足，提供一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法。该方法通过模拟反硝化聚磷菌的生存环境，设计厌氧-缺氧两相交替条件，分别在厌氧相采用含外加碳源无磷培养基、缺氧相采用无外加碳源含磷培养基进行选择性筛选，极大的缩短了筛选周期。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：