[发明专利]一种用于荧光定量PCR的预装试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及的是一种用于荧光定量PCR的预装试剂及其制备方法。

背景技术

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。QRT-PCR技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

实时荧光定量PCR常用SYBRGreenΙ和TaqMan探针法进行检测，SYBRGreenΙ在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料，只有掺入DNA双链的SYBR染料特异性地发出荧光信号，而没有掺入的SYBR不发出荧光信号，所以荧光信号的增加和PCR的产物增加是同步的。TaqMan探针带有荧光猝灭基团能够吸收报告基团发射的荧光信号，在PCR过程中Taq酶的外切酶活性将探针没切降解，荧光基团和荧光猝灭基团分离开，从而荧光信号能够被监测到。所以每扩增一条新DNA链，就能够形成一个荧光信号分子，荧光信号的累积和PCR产物的产生是同步的。

实时荧光定量PCR被应用于基因表达研究、转基因研究、SNP及突变分析等，在医学研究领域常用于病原体检测、药物疗效考核、肿瘤基因检测等。实时荧光定量PCR相比较与一般PCR有特异性强、定量准确、重复性好、效率高、应用范围广等优点。但是，存在运输不便，操作复杂，对实验者技术要求较高，污染的可能性大的问题，实时荧光定量PCR反应试剂中含有DNA聚合酶和荧光染料，在常温下难以保持，很快失效，即使在2-8℃条件下保存，也就只能存放3个月左右；-20℃条件下保存时间虽然能够延长至1年，由于每次使用需要经过反复冻融，也会使试剂的活性受到影响。并且存放时不能将各组分混合，使用时再逐个加入，操作复杂，易污染。因此，市场缺少能在4℃或常温保存的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种用于荧光定量PCR的预装试剂，其中涉及一种冻干保护试剂，为荧光定量PCR试剂的冻干技术提供有效的保护体系；本发明的另一目的是提供一种用于荧光定量PCR的预装试剂的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于荧光定量PCR的预装试剂，其特征在于：包括以下组分：DNA聚合酶、Buffer、Mg²⁺、dNTPs、SYBR GreenΙ染料、ROX校正染料和低温冻干保护剂。

优选的，上述组分的终浓度如下：DNA聚合酶的浓度为0.05U/ul，10×Buffer、Mg²⁺浓度为4mM，dNTP混合物浓度为0.4mM，2×SYBR GreenΙ染料，低温冻干保护剂1.2-7mM。

优选的，所述低温冻干保护剂包含：海藻糖、蔗糖和牛血清白蛋白。

作为优选，所述低温冻干保护剂组分的终浓度如下：海藻糖5-20g/L，蔗糖1-5g/L和牛血清白蛋白1-5g/L。

一种用于荧光定量PCR的预装试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将荧光定量PCR反应体系混合液(DNA聚合酶的浓度为0.05U/ul，10×Buffer，Mg²⁺浓度为4mM，dNTP混合物浓度为0.4mM，2×SYBR GreenΙ染料和ROX染料)和低温冻干保护剂按照使用浓度比例混匀；

(2)将混匀后的液体放入冷冻干燥箱中，隔板温度为-45～-55℃，进行预冻3-5h；

(3)进一步升华，保持冷冻干燥2-4h；

(4)重复步骤(3)两次，得到最终的PCR扩增冻干预存试剂；

(5)将PCR扩增冻干预存试剂分装进反应管中，在反应管的1号管中单独加入内参基因的引物序列。

优选的，上述步骤1)中PCR反应体系混合液和低温冻干保护剂按照使用浓度比例为3.6-6.2：13-17。

作为优选，上述步骤5)中的反应管为八连96孔板反应管。

作为优选，所述八连96孔板反应管的每个反应管使用时总反应体积为20μl。

优选的，上述步骤5)中的内参基因引物可分为动物来源的和植物来源的，

动物来源的内参基因引物序列如下：

GAPDH F：5’-TGGCACCCAGCACAAATGAA-3’

GAPDH R：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’