[发明专利]避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法

权利要求书

1.避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

将肌原纤维蛋白样品的蛋白浓度调至2μg/μL；

将蛋白marker及肌原纤维蛋白样品分别上样至不同电泳泳道，电泳电压采用恒压200V，待肌原纤维蛋白样品溴酚蓝标记跑至距离胶底物0.5mm停止电泳；

通过蛋白质免疫印迹方法检测肌原纤维蛋白样品中丝氨酸磷酸化水平；

其中，

蛋白marker与肌原纤维蛋白两条泳道之间留一条空白泳道；

与第一抗体混合之前，沿蛋白marker用铅笔水平划线并延伸至蛋白marker与肌原纤维蛋白间空余的条带，并将该条带垂直剪开，将剩余肌原纤维蛋白部分与所述第一抗体混合孵育。

2.如权利要求1所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，其特征在于，

对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为7.5％；

对于分子量高于40KDa且小于100KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为10％；

对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为12％。

3.如权利要求1所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，其特征在于，

蛋白marker上样量为2μL；

对于肌原纤维蛋白中含量较高的肌球蛋白重链、肌动蛋白上样量为2.5μg，对于其他肌原纤维蛋白上样量为10μg。

4.如权利要求1所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，其特征在于，通过蛋白质免疫印迹方法检测所述肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平过程中，与所述肌原纤维蛋白反应的第一抗体采用丝氨酸磷酸化单克隆抗体，所述第一抗体的浓度为60-80μg/ml。

5.如权利要求4所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，其特征在于，通过蛋白质免疫印迹方法检测所述肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平过程中，与所述第一抗体结合的第二抗体采用羊抗鼠IgG，所述第二抗体的浓度为0.05-0.2μg/mL。

6.如权利要求2所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，其特征在于，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的肌原纤维蛋白样品的丝氨酸磷酸化水平过程中，

对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，4.5min；

对于分子量高于40KDa且小于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，3.5min；

对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，2.5min。

7.如权利要求6所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，其特征在于，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的肌原纤维蛋白样品的丝氨酸磷酸化水平过程中，

若检测目标非肌球蛋白重链、肌动蛋白，在与第一抗体混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量大于220KDa条带、40-45KDa条带部分，将剩余部分切角标记，与第一抗体混合；

若检测目标为肌球蛋白重链与肌动蛋白，与第一抗体混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量180KDa条带以下部分、及34-55KDa条带部分，将剩余部分切角标记。

8.如权利要求1所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述肌原纤维蛋白样品取自羊。