[发明专利]避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法

说明书

本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，通过蛋白质免疫印迹技术在宰后肌肉中检测出不同肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平，所需的肌肉样品量少，操作过程较为简单，重复性好，检测所得条带清晰，实验价格低，是一种高效测定宰后肌肉中肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的方法。利用该方法可对羊骨骼肌中丝氨酸磷酸化肌原纤维蛋白的生化变化进行研究分析，也可延伸至其他动物肌肉生理生化的研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及到一种避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法。

背景技术

蛋白质磷酸化修饰是调控蛋白质结构与功能的重要途径，目前关于蛋白质磷酸化水平的方法主要集中在测定整体磷酸化水平。磷酸化修饰可能发生在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸上，其中丝氨酸的磷酸化修饰是数量最多的，对于肌原纤维蛋白磷酸化的生化变化进行研究，以及基于肌原纤维蛋白磷酸化对动物肌肉生理生化的研究是科学研究中必不可少的。虽然现有技术中也有针对某种氨基酸的特异性抗体，但是肌原纤维蛋白种类繁多，各类之间含量差异巨大，虽然质谱可以检测到多种蛋白的磷酸化水平及磷酸化位点，但是单次检测样品少，价格高，数据分析复杂，目前还没有针对某种肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的免疫印迹检测方法。因此，一种可多蛋白识别、检测快速、价格低的测定肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的方法是亟需的。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，按不同肌原纤维蛋白含量、分子量、信号响应值将不同肌原纤维蛋白区分开进行免疫印迹。

本发明再有一个目的是提供一种避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，避免各种肌原纤维蛋白之间丝氨酸磷酸化信号互相干扰，通过利用免疫印迹实现了对不同肌原纤维蛋白磷酸化水平的测定，解决了现有方法中不能准确检测某一种肌原纤维蛋白、操作繁琐、费用昂贵的问题。

本发明提供一种避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，包括以下步骤：

将肌原纤维蛋白样品的蛋白浓度调至2μg/μL；

将蛋白marker及肌原纤维蛋白样品分别上样至不同电泳泳道，电泳电压采用恒压200V，待肌原纤维蛋白样品溴酚蓝标记跑至距离胶底物0.5mm停止电泳；

通过蛋白质免疫印迹方法检测肌原纤维蛋白样品中丝氨酸磷酸化水平。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，蛋白marker与肌原纤维蛋白两条泳道之间留一条空白泳道。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，

对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为7.5％；

对于分子量高于40KDa且小于100KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为10％；

对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为12％；

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，

蛋白marker上样量为2μL；

对于肌原纤维蛋白中含量较高的肌球蛋白重链、肌动蛋白上样量为2.5μg，对于其他肌原纤维蛋白上样量为10μg。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，通过蛋白质免疫印迹方法检测所述肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平过程中，与所述肌原纤维蛋白反应的第一抗体采用丝氨酸磷酸化单克隆抗体，所述第一抗体的浓度为60-80μg/ml。