[发明专利]一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法

权利要求书

1.一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)称取桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干；

2)将烘干的样品以1∶95-105的浴比在含有0.4-0.6wt％Na₂HPO₄和0.8-1.2wt％C₁₇H₃₅COONa的混合溶液中煮沸25-35min，进行脱胶处理，共脱胶两次；

3)脱胶之后，将样品用去离子水冲洗干净，放入55-65℃烘箱，得到干燥的丝素纤维；

4)取直径相近的丝素纤维，等质量分为A、B、C、D、E五组，其中A组作为对照组，不做任何处理；

5)将B、C、D、E组浸入到胰蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B组残余丝素；

6)将步骤5)酶解过的C、D、E组浸入到碱性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C组残余丝素；

7)将步骤6)酶解过的D、E组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D组残余丝素；

8)将步骤7)酶解过的E组浸入到胰弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；

9)对B、C、D、E组残余丝素进行过滤和洗涤处理，得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余丝素；

10)利用氨基酸自动分析仪对A和B、C、D、E组残余丝素进行氨基酸分析，可得到各组中氨基酸的种类和含量。

2.如权利要求1所述的一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法，其特征在于，步骤5)中酶解反应具体为：将B、C、D、E组以1∶40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的胰蛋白酶溶液中，控制反应温度45-50℃，溶液pH 7～9，反应时间为6h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B组残余丝素。

3.如权利要求1所述的一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法，其特征在于，步骤6)中酶解反应具体为：将步骤5)酶解过的C、D、E组以1∶40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的碱性蛋白酶溶液中，控制反应温度40～55℃，溶液pH 9～10，继续反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C组残余丝素。

4.如权利要求1所述的一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法，其特征在于，步骤7)中酶解反应具体为：将步骤6)酶解过的D、E组以1∶40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的木瓜蛋白酶溶液中，控制反应温度50～60℃，溶液pH 6～7，继续反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D组残余丝素。

5.如权利要求1所述的一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法，其特征在于，步骤8)中酶解反应具体为：将步骤7)酶解过的E组以1∶40的浴比放入预先配制好的1.0g/L的胰弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度35～39℃，溶液pH8.5～9.2，继续反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理。

6.如权利要求1-5之一所述的一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法，其特征在于，步骤5)至步骤8)中的酶溶液需要现配现用；同时需要用0.1％Na₂CO₃溶液调节溶液pH。

7.如权利要求1-5之一所述的一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法，其特征在于，步骤5)至步骤8)中灭酶处理为：在90℃的烘箱中保温1h或改变溶液的pH使溶液呈现过酸或过碱，使酶失活。