[发明专利]一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法

说明书

本发明涉及蚕丝领域，公开了一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法。本发明先采用碱法脱胶对桑蚕丝和进行脱胶处理，得到丝素纤维，对丝素纤维进行分组，然后分步采用不同蛋白酶对丝素纤维由外及内依次进行酶解，最后利用氨基酸分析对水解程度不同的残余丝素中各种氨基酸的含量进行测定，可以得到各氨基酸在桑蚕丝中的径向分布。本发明根据桑蚕丝丝素纤维径向上氨基酸分布的特点，采用多次酶解法对丝素蛋白进行溶解，特异性高，作用条件温和，对氨基酸的破坏小，使结果更准确。

技术领域

本发明涉及蚕丝领域，尤其涉及一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法。

背景技术

蚕丝是一种动物蛋白纤维材料，主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，其中丝素蛋白约占70％，是蚕丝的主要成分，决定蚕丝的性质和用途。桑蚕丝是生活中比较常见的蚕丝之一，其在各领域中都有实际应用。

丝素基质在蚕体内的生化合成十分复杂，不同蚕丝腺内的丝素蛋白原液不同，而且在吐丝过程中，丝素原液受到蚕体内的压力及口器的作用，会表现出不同的流变性，最终导致不同种类蚕丝丝素的分子结构和超分子结构等微结构的不同。

桑蚕丝和柞蚕丝丝素蛋白中含有18种氨基酸(不含有20种基本氨基酸中的谷氨酰胺和天冬酰胺)，主要由甘氨酸(Gly)、丙氨酸(A1a)、丝氨酸(Ser)和酪氨酸(Tyr)组成。桑蚕丝素中四种氨基酸的含量在85％以上，而柞蚕丝素中四种氨基酸含量在82％以上。此外，经过研究发现，除了不同种类的蚕丝其氨基酸分布不同之外，同一桑蚕丝的氨基酸在其径向上的分布是不同的。

为了实现桑蚕丝更好地进行利用，有必要比较研究桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸的径向分布和变化规律。目前，在研究过程中，可通过使用酸、碱溶液或各种蛋白酶对丝素蛋白进行不同程度(通过控制水解/酶解时间的长短来实现径向上的逐层侵蚀)的溶解，以得到残余的丝素纤维，再采用红外光谱、X射线衍射等技术进行分析。但上述溶解方法容易损伤氨基酸，并且容易对丝素纤维内层暂时不希望被水解的蛋白质造成误水解/酶解，从而造成分析结果不够准确。此外，上述方法还无法进行较详细的定量研究。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法。本发明根据桑蚕丝丝素纤维径向上氨基酸分布的特点，采用多次酶解法对丝素蛋白进行溶解，特异性高，作用条件温和，对氨基酸的破坏小，使结果更准确。

本发明的具体技术方案为：一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)称取桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。

2)将烘干的样品以1∶95-105的浴比在含有0.4-0.6wt％Na₂HPO₄和0.8-1.2wt％C₁₇H₃₅COONa的混合溶液中煮沸25-35min，进行脱胶处理，共脱胶两次。

本发明在脱胶过程中，加入C₁₇H₃₅COONa缓冲剂，提高脱胶效率，同时减少对丝素纤维的伤害。

3)脱胶之后，将样品用去离子水冲洗干净，放入55-65℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。

4)取直径相近的丝素纤维，等质量分为A、B、C、D、E五组，其中A组作为对照组，不做任何处理。

5)将B、C、D、E组浸入到胰蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B组残余丝素。

6)将步骤5)酶解过的C、D、E组浸入到碱性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C组残余丝素。

7)将步骤6)酶解过的D、E组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D组残余丝素。