[发明专利]检测BCR‑FGFR1融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供检测样本中BCR-FGFR1融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒，采用探针Taqman实时荧光定量PCR技术，用于检测人类8p11骨髓增殖综合征(EMS)患者体内BCR-FGFR1融合基因表达水平，同时对高危人群进行较为准确的筛查。该试剂盒可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

染色体易位，形成融合基因，进而导致酪氨酸激酶的组成型表达在血液恶性肿瘤，尤其是骨髓增生综合征的疾病的发生发展中起到非常重要的作用。

纤维母细胞生长因子受体1(FGFR1)基因定位于染色体的8p11，其编码的FGFR1蛋白是受体酪氨酸激酶家族成员之一。FGFR1蛋白拥有胞外受体结合域、跨膜区和胞内酪氨酸激酶催化域，在非激活状态时以单体形式存在。其在染色体易位时也会受到同样的激活，进而导致疾病的发生。

8p11骨髓增殖综合征(EMS)是一种的伴FGFRl基因重排的非常罕见的侵袭性血液肿瘤，其主要生物学特征为：染色体涉及8p11异常，常伴嗜酸细胞增多，淋巴结肿大并伴有淋巴母细胞淋巴瘤，短期内迅速进展为急性血液病。

目前已报道FGFR1的伙伴基因有14种，而BCR-FGFR1融合基因相对罕见，该融合基因将导致BCR基因第4号外显子和FGFR1基因的第9号外显子相连接。2004年，Roumiantsev等以小鼠模型证实BCR-FGFR1蛋白很可能通过BCR的177位酪氨酸和GRB蛋白结合，参与BCR-ABL信号通路传导，导致小鼠产生CML样的白血病。

在疾病发生的早期使用针对性的靶向药物对此类疾病的治疗来说十分重要，大多数CML新诊患者的可通过口服伊马替尼出现完全细胞遗传学缓解，但是由于对这类疾病缺乏足够认识，许多患者丧失最佳治疗时机。故融合基因BCR-FGFR1的检测的开展有利于疾病的早期诊断和治疗。

发明内容

本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因abl和目的基因BCR-FGFR1的定量标准曲线，检测BCR-FGFR1的相对于内参基因的表达水平。试剂盒通过调整两个基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

本发明中的“BCR-FGFR1cDNA序列”指的是BCR-FGFR1融合基因经转录后产生的mRNA经逆转录后产生的cDNA序列，或者根据这种cDNA序列通过化学合成手段直接合成出。不论是经过逆转录还是通过化学合成手段直接产生的cDNA序列插入到合适的质粒后，可作为阳性对照品进行使用。

本发明提供了用于检测样本中BCR-FGFR1融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括检测BCR-FGFR1融合基因的上游引物BCR-FGFR1-F、下游引物BCR-FGFR1-R和探针BCR-FGFR1-Probe，其碱基序列为：

BCR-FGFR1-F:GAAGCCTTTGAAAGCCGC；

BCR-FGFR1-R:GAGTCCCACTGGAGGAGAGC；

BCR-FGFR1-Probe:FAM-TGATGGCCGAACCAGAAGAACCC-TAMRA。

进一步地，BCR-FGFR1-F：BCR-FGFR1-R：BCR-FGFR1-Probe的摩尔比为2:2:1。

进一步地，所述寡核苷酸还包括检测abl内参基因的上游引物abl-F、下游引物abl-R和探针abl-Probe，其碱基序列为：

abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA；

abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA；

abl-Probe:FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT–TAMRA。

进一步地，abl-F：abl-R：abl-Probe的摩尔比为2:2:1。

本发明还提供一种检测样本中BCR-FGFR1融合基因的方法，其步骤如下所示：

(1)提取样本中的RNA；

(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；

(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用检测BCR-FGFR1融合基因的上游引物BCR-FGFR1-F、下游引物BCR-FGFR1-R和探针BCR-FGFR1-Probe检测样本中的BCR-FGFR1融合基因荧光信号；利用检测abl内参基因的上游引物abl-F、下游引物abl-R和探针abl-Probe检测样本中的abl内参基因荧光信号，其中