[发明专利]一种厌氧菌培养装置及培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种专门用于培养厌氧菌的装置和方法，尤其是涉及一种用苛氧菌进行厌氧培养的装置及方法。

背景技术

厌氧菌(Anaerobic bacteria)是指一类需要生长在低氧或无氧条件下的微生物，因为厌氧微生物没有完整的代谢酶系，故以无氧发酵的方式进行能量代谢，其生存需在较低的氧化还原电势条件下才能进行。动物体内的一些低氧化还原电势的组织为厌氧菌的生长繁殖提供了有利条件。厌氧菌的研究一直是临床医学的重心。厌氧菌可进入血液引起菌血症、败血症等，严重威胁病人生命。近10年来研究证明，无芽胞厌氧杆菌及球菌是细菌性感染的重要原因之一，当深部脓肿、败血症等常规细菌学检查阴性时，往往源于厌氧菌感染.厌氧菌感染是一种内源性感染，病原菌遍及临床各科，人体的各个部位，各种器官均可发生厌氧菌感染，据文献报道，10％的菌血症可检出厌氧菌，牙源性口面部感染病例中有94％，吸入脚市炎及肺脓肿时有93％，妇产科各种感染性疾病中有100％，直肠周围脓肿有77％可检出厌氧菌，而且有相当一部分病例是单一的厌氧菌感染。

同时，厌氧菌是研究微观生态平衡、失调和调整的重要部分，在消化道菌群中， 99％以上为厌氧菌，它们组成了重要的消化菌群，并在生物拮抗、营养、免疫等方面具有不可估量的意义。另外，以消化道菌群为研究对象的微生态学已取得了大量科研成果，厌氧微生物的分离、培养、筛选，有利于发现更多有益功能的微生物，丰富微生物菌种质资源，有利于人类进一步揭示厌氧微生物与宿主营养、免疫和健康这间的关系。目前，国内外在医学、食品和饲料领域等众多科研和企业对此领域产生了浓厚兴趣。这些研究都说明了厌氧菌的研究对于人或经济物种的疾病防治具有重大意义。

目前常见的厌氧分离培养方法常采用琼脂稀释振荡法(Agar Shake Dilution Method)、亨盖特滚管技术(Hungate Roll-tube Technique)、厌氧罐(Anaerobic Jar) 或厌氧袋(Bio-bag)培养法、厌氧手套操作箱。近几年，有些学者将应用于好氧培养的高通量分选技术应用到厌氧培养。

琼脂稀释振荡法是将菌液进行浓度梯度稀释后注入50℃左右的无氧液态琼脂培养基试管中，振荡使混匀，待培养基凝固之后，加入石蜡密封，培养一段时间后可在琼脂柱内部或试管内壁长出肉眼可辨菌落。该方法的缺点在于由于有的菌落会生长在凝固的琼脂中，所以不利于观察菌落形态，也给单菌落的挑取带来不便。

亨盖特滚管技术是美国著名的微生物学家Hungate在1950年发明，后经不断改进，目前应用也较多。其原理是利用高温加热的铜柱消耗空气中的氧气反应来获得高纯氮气培养环境，并在培养基配制和分装过程中使用高纯氮气驱逐空气。从培养基的配制到菌种的接种及培养等过程都在高度无氧条件下，从而保证严格厌氧菌的存活。该方法是将菌液进行浓度梯度稀释后注入50℃左右的无氧液态琼脂培养基中，然后用滚管机滚管或将试管水平放置于冰块中迅速滚动，使含有菌的培养基在试管内壁上凝固成一层匀质的琼脂膜。该技术与琼脂稀释振荡法相比，克服了前者难以观察单菌落的缺点，但单菌落的挑取仍然不容易进行，操作繁琐，技术要求较高。

厌氧袋是一种塑料材质、透明而不透气的可密封的袋子，装入培养皿后，再放入产气袋，使袋内氧气被消耗。也可抽真空/充氮气反复进行2-3次以排除袋内氧气。厌氧袋轻便易操作，是广受推崇的厌氧培养容器。但该方法厌氧袋容量小，且已破损漏气，使得环境很不恒定，培养批次不够均一。

厌氧罐法是把培养物放进罐中，然后抽气/充气(氮气或混合气体，含氢气)，其内部的氧气和氢气在催化剂的作用下反应生成水，从而清除了内部少量的氧气。厌氧手套操作箱的出现，使厌氧菌的研究得到了发展，尤其是培养、研究严格厌氧菌，其解决了长久以来使用厌氧罐或厌氧袋无法进行厌氧操作的问题，使厌氧培养实现了类似好氧培养的过程。该仪器采用抽真空充氮气的方法以排除实验操作过程中带入的大部分氧气。随后真空/充氮的技术渐渐显现出不足之处。最大的缺点在于每次操作过程中样品或实验用品放入箱内时，都要反复进行抽气/充氮，过程繁复且耗费大量气体；真空泵磨损也会使维护成本升高。后来，有人针对这些缺陷对厌氧手套箱进行了技术升级。实现了无真空充氮操作，利用钯的催化作用将厌氧操作箱内的氧气与混合在氮气中的氢气催化生成水，以耗尽厌氧手套操作箱内部的氧气。但是需要使用的氢气给厌氧手套操作箱的使用带来了一定的安全隐患。厌氧手套操作箱经过多年的改良和设计，除了运行成本高等问题，是目前做厌氧研究最为便利有效的仪器。