[发明专利]一种κ-卡拉胶酶及其基因和应用

权利要求书

1.一种编码κ-卡拉胶酶的基因car 30，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种由权利要求1所述基因编码的κ-卡拉胶酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种含有如权利要求1所述编码κ-卡拉胶酶的基因car 30的重组质粒。

4.如权利要求3所述的一种重组质粒，其特征在于：所述κ-卡拉胶酶基因连接在pET-28a上。

5.一种含有如权利要求3或4所述的重组质粒的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌为生产κ-卡拉胶酶的大肠杆菌BL21(DE3)。

6.一种权利要求5所述基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）以食鹿角菜假交替单胞菌基因组DNA为模板；正向引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；扩增κ-卡拉胶酶基因car 30序列；应用Taq DNA聚合酶，在PCR仪中进行扩增，扩增温度参数：95℃，5 min；94℃变性，60 s；50℃退火，45 s；72℃延伸，60 s，30个循环；4℃保持；用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳对扩增样品进行检测；

（2）切胶回收目的产物与pET-28a载体用EcoRI和BamHI同时双酶切，酶切产物用凝脂糖凝胶电泳验证；

（3）对酶切产物与pET-28a载体验证正确后，在连接酶作用下连接，连接体系如下：待连接的DNA片段11 μL，线性载体质粒6 μL，缓冲液2 μL，连接酶1 μL，16℃连接16 h；然后将连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)，并用含有50 μg/mL氨苄青霉素和50 mg/mL X-gal的平板进行蓝白斑筛选，筛选阳性转化子，进行菌液PCR，然后进行琼脂糖凝胶电泳验证，获得了阳性克隆。

7.一种如权利要求5所述的基因工程菌的表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

取500 μL构建正确的基因工程菌的菌液，接种于含50 μg/mL卡那霉素的50 mL LB培养基中，于37℃、200 r/min振荡培养至OD₆₀₀达0.8，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0.05 mmol/L，于10℃诱导培养24 h；冷冻离心收集菌体，用破壁缓冲液重悬菌体；超声破壁后的菌液冷冻离心取上清，制得重组κ-卡拉胶酶。

8.一种权利要求2所述的κ-卡拉胶酶在制备κ-卡拉胶寡糖中的应用。