[发明专利]一种κ-卡拉胶酶及其基因和应用

说明书

本发明公开了一种κ‑卡拉胶酶及基因和应用，将克隆得到的食鹿角菜假交替单胞菌的κ‑卡拉胶酶前体基因car 30，转化大肠杆菌内，得到产重组κ‑卡拉胶酶的重组菌，该重组κ‑卡拉胶酶的最适温度和pH分别为45℃和6.5；在40℃下保温30 min，残余酶活为80.0%以上，在pH 6.5‑7.5的缓冲液中处理60 min，酶活力仍能保持50.0%以上。本发明构建了含κ‑卡拉胶酶基因car 30的重组载体，实现了异源表达，同时为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。表达的κ‑卡拉胶酶对κ‑卡拉胶有较好的降解效果，降解κ‑卡拉胶生成二糖、四糖等，可在制备抗菌剂，抗病毒剂，免疫调节剂，抗氧化剂等中应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于食鹿角菜假交替单胞菌（P. carrageenovora ASY5）的κ-卡拉胶酶基因car 30的克隆及重组κ-卡拉胶酶构建和应用。

背景技术

卡拉胶是存在于海洋红藻细胞壁中的一种结构性多糖，是D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖单元由β-1,3和α-1,4-糖苷键交替连接形成的。大量研究证实，卡拉胶的降解产物卡拉胶寡糖及其衍生物具有抗病毒、抗肿瘤、抗HIV、免疫调节等多种生理活性，具有较高的药用开发价值。

目前，卡拉胶寡糖的制备方法主要有还原水解法、自由基解聚法、化学降解法和酶解法。毋庸置疑，酶解法具有特异性强、产物单一、反应条件温和等特点，因此，酶解法制备卡拉胶寡糖是一种理想手段。

利用自然界选育得到的菌株直接发酵生产卡拉胶酶，产量低、培养条件复杂、产酶不稳定、酶纯化成本高，因此难以用于大量生产卡拉胶酶。利用基因工程的方法，将自然界中分离得到的卡拉胶酶基因进行异源表达，以期提高卡拉胶酶的表达量并实现大量制备，是目前研究的热点方向。但是，现已经报道的重组卡拉胶酶的温度稳定性较差，0-30℃时大多数的卡拉胶酶可以保持较高活性，在温度高于40℃条件下酶活力损失较大，pH大于6.0时酶活性开始下降，因此，从自然界获取具有较好耐热性能卡拉胶酶并在大肠杆菌中大量表达，这对于卡拉胶酶的大规模制备和卡拉胶寡糖的工业化生产具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种κ-卡拉胶酶及其基因和应用，通过从食鹿角菜假交替单胞菌中克隆一种κ-卡拉胶酶基因并转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 内，以得到一种高效表达κ-卡拉胶酶的基因工程菌。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种编码κ-卡拉胶酶的基因car 30，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因的ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。

一种κ-卡拉胶酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种含有编码κ-卡拉胶酶基因car 30的重组质粒。

作为实施例的优选方式，所述的κ-卡拉胶酶基因连接在pET-28a上。

一种含有重组质粒的基因工程菌。

作为实施例的优选方式，所述的基因工程菌为生产κ-卡拉胶酶的大肠杆菌BL21(DE3)。

一种编码κ-卡拉胶酶的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

（1）以食鹿角菜假交替单胞菌（P. carrageenovora ASY5，保藏于中国工业微生物保藏管理中心（CICC），保藏编号为23819）基因组DNA为模板，使用P. carrageenovora ASY5 κ-卡拉胶酶基因的

正向引物为：5ʹ-CCGGAATTCCAAGAGTTTAAAAAACTA-3；