[发明专利]一种基于联合法分离外泌体的方法

权利要求书

1.一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，采用微孔过滤和超滤离心相结合的方式进行：采用微孔滤膜对待分离样品进行过滤处理，以去除大尺寸微泡，控制微孔滤膜的孔径为大于0.1μm；将微孔过滤得到的滤液进行超滤离心处理，以去除小尺寸杂蛋白，得到含有外泌体的上清液，超滤管的截留分子量为1kDa-400kDa，在3-5℃离心10-20min，离心速度为80×g-12000×g。

2.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，先进行超滤离心处理待分离样品，以去除小尺寸杂蛋白，再进行微孔滤膜过滤，以去除大尺寸微泡，得到含有外泌体的上清液。

3.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，在微孔过滤中，待分离样品为肿瘤细胞培养基、正常组织细胞培养基、各种生物体液，如血液(血清)、唾液、尿液、精液、母乳。

4.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，在微孔过滤中，微孔滤膜的材质为纤维树脂膜或尼龙膜，微孔滤膜的孔径大于0.12μm，优选大于0.15μm，如0.1μm-10μm，微孔过滤次数为1-100次，优选10—80次。

5.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，在超滤离心中，小尺寸杂蛋白的尺寸为30nm一下，如10—30nm。

6.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，在超滤离心中，超滤管的截留分子量3kDa-300kDa(数均)，超滤条件为4℃，12-18min，离心速度为100×g-10000×g；超滤过滤次数为1-100次，优选10—60次。

7.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，选择加入超顺磁纳米颗粒和配体的复合物进一步提升分离效果，超顺磁纳米颗粒和配体的复合物为超顺磁纳米颗粒-配体复合物，选择超顺磁纳米颗粒与激活的硫醇基配体反应制备，配体与2-亚氨基四氢噻吩反应得到激活的硫醇基配体，或者超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物，选择聚乙二醇化的超顺磁纳米颗粒与激活的硫醇基配体反应制备，氨基官能化的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺进行反应，以实现超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化；配体与2-亚氨基四氢噻吩反应得到激活的硫醇基配体。

8.根据权利要求7所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，配体采用CD63抗体、CD9抗体、CD81抗体、CD82抗体、ALIX抗体、Tsg101抗体或者转铁蛋白中的一种；在超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化中，活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的数均分子量为1000-100000，磁分离时间为10-5000min；优选活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的数均分子量为4000-10000，磁分离时间为60-200min；配体与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为(1-10000)：(1-10000)，优选(10-1000)：(10-1000)，更加优选(10—100)：(600—1000)；氨基官能化的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比为(1-10000)：(1-10000)，优选(10-1000)：(10-1000)，更加优选(10—100)：(500—1000)。

9.如权利要求1所述的方法得到的外泌体在制备治疗剂载体中的应用。

10.如权利要求7所述的方法得到的外泌体在制备靶向治疗药物载体中的应用。