[发明专利]一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法

说明书

本发明涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。本发明制备的产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、含有3个氨基酸突变的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、疫苗效力远高于现有疫苗等优点，较我国目前商品化的产气荚膜梭菌天然毒素灭活疫苗大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是我国现行D型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

技术领域

本发明涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。

背景技术

产气荚膜梭菌也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患病，该病原是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症的主要病原之一，对畜牧业造成了巨大的经济损失。产气荚膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，该菌可产生至少18种外毒素，并通过其产生的毒素发挥致病作用。根据产生4种主要致死性外毒素α、β、ε和ι的种类，将该菌分为A、B、C、D、E五个毒素型。产气荚膜梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病，往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法。

目前使用的商品化疫苗主要为灭活疫苗，在预防动物产气荚膜梭菌病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。

ε毒素是由B型和D型产气荚膜梭菌产生，全长296个氨基酸，以前毒素的形式分泌于菌体外。前毒素被宿主的胰蛋白酶和糜蛋白酶或梭菌自身的蛋白酶作用后，去除N端11-13个以及C端22-29个氨基酸，从而活化为成熟毒素。ε毒素属于β穿孔素家族成员，是产气荚膜梭菌毒素中毒力最强的毒素，其毒力仅次于肉毒杆菌素和破伤风神经毒素，是目前已知第三强的梭菌类毒素。因此，实现毒素的减毒甚至无毒以及构建相关减毒或无毒体，对于开发毒素基因工程亚单位疫苗以及其作为抗原组分的多价亚单位疫苗的研究和应用就显得尤为重要。

现有技术中对产气荚膜梭菌主要外毒素蛋白的表达与纯化方法相对复杂，表达产物通常以不溶性的包涵体形式存在，可溶性蛋白表达的报道在国内外非常少。因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高，这是限制其应用的主要制约因素。采用可溶性表达方式可很好的克服这一问题。如何构建可溶性表达载体并且优化可溶性蛋白的高效表达方法，是本领域长期以来一直研究的热点课题。

目前虽然已有产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体的报道，如中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于力等(“产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体及其应用”，申请号：201410707351.6)将野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素的第71位酪氨酸突变为非芳香族氨基酸，获得了对于细胞或动物体减毒的ε毒素突变体，由于该申请仅突变1个氨基酸，易发生回复突变而重新成为毒力极强的毒素，从而给未来实际的疫苗大规模生产带来严重的生物安全风险。中国动物疫病预防控制中心宋晓晖等(“抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε蛋白及其制备方法与应用”，申请号：201610301989.9)设计了3种重组ε毒素蛋白，但均缺失了野生型ε毒素蛋白的前50个氨基酸残基，这种采用蛋白片段作为免疫原的策略，很可能会导致抗原蛋白的抗原性不完整，从而影响其免疫原性。