[发明专利]一种磁分离均相免疫检测目标蛋白的方法在审
申请号: | 201711039199.9 | 申请日: | 2017-10-31 |
公开(公告)号: | CN107884586A | 公开(公告)日: | 2018-04-06 |
发明(设计)人: | 吴灿军 | 申请(专利权)人: | 吴灿军 |
主分类号: | G01N33/68 | 分类号: | G01N33/68;G01N33/543;G01N33/533 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 分离 均相 免疫 检测 目标 蛋白 方法 | ||
技术领域
本发明涉及生物检测领域,具体涉及一种磁分离均相免疫检测目标蛋白的方法。
背景技术
免疫分析根据测定过程中是否要将待测物质与反应体系分离可分为非均相免疫分析和均相免疫分析;非均相免疫分析涉及抗原(抗体)的固定和清洗分离步骤,使检测时间增长;均相免疫分析指在测定过程中将待测物与反应体系中的相关试剂液相混合反应后直接测定,整个反应在15-30分钟内完成,较非均相免疫分析显著减少检测时间数小时以上,均相发光免疫分析具有均相、一步、免清洗和高通量检测等一系列优点,使检测精密性更高,因此更受青睐。目前,多种灵敏的检测方法已被应用于均相免疫分析,分为(1)直接化学发光:如Roche电化学发光和吖啶酯化学发光;(2)酶促化学发光(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)。直接化学发光是指在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用,直接参与发光反应,它们在化学结构上有产生发光的特有基团,可直接标记抗原或抗体。但发光试剂通常热稳定性较差,不便于长期保存。酶促化学发光是利用标记酶的催化作用,使发光剂(底物)发光,这一类酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)作为标记酶的均属酶促发光。但较直接化学发光相比,酶促化学发光定量通常线性较差,准确定量较难。
以电化学发光为例,阐明均相化学发光的原理和步骤。在电化学发光免疫分析系统中,磁性微粒为固相载体包被抗原(抗体),用三联吡啶钌标记抗原(抗体),在反应体系内待测标本与相应的抗原(抗体)发生免疫反应后,形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物,这时,将上述复合物吸入流动室,同时引入TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时,被安装在电极下面的电磁铁吸引住,而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压,启动电化学发光反应,使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移,产生电化学发光,光的强度与待测抗原浓度成正比。化学发光类检测存在的缺陷是检测试剂热稳定性差。
时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术,它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。时间分辨荧光法已被用于固相包被的非均相免疫检测技术,用于临床检测具有很好的检测灵敏度、准确性和重复性,且检测试剂稳定性非常强。但存在的缺陷是检测时间过长。目前时间分辨荧光未用于磁分离均相免疫检测。
降钙素原(Procalcitonin,PCT)最初是诊断细菌性感染的一种标志物,随后的研究发现降钙素原也可以作为急性胰腺炎、细菌性脑膜炎、肾炎等诸多炎症的标志物,PCT的临床检测也越来越重要,检测敏感性要求也越来越高。现在临床上的半定量检测的免疫层析法(BRAHMS PCT-Q,Henningsdorf,Germany),灵敏度低、检测不准确;酶联免疫检测(ELISA)操作太繁琐;铕离子荧光微球是单个纳米级聚苯乙烯微粒包裹无数经过螯合的铕离子荧光,是时间分辨荧光技术和纳米技术的结合;而且铕离子荧光微球表面修饰有如羧基、氨基等功能性基团,用以偶联标记蛋白,提高蛋白的标记效率。由于铕离子荧光微球不需要经过解离增强液增强荧光信号,使得铕离子荧光微球能够在多种检测技术中得到很好的应用。但目前尚未有铕离子荧光微球用于磁分离均相免疫检测目标蛋白的报道。
发明内容
本发明公开了一种用铕离子荧光微球进行磁分离均相免疫检测目标蛋白的方法。该方法包括以下步骤:首先是目标蛋白检测抗体标记铕离子荧光微球:以铕离子荧光微球为标记物,通过EDC/NHS活化铕离子荧光微球,将活化的铕离子荧光微球偶联抗目标蛋白检测抗体。然后是目标蛋白固相抗体标记生物素。然后是通过表面修饰有链霉亲和素的磁珠分离游离的荧光微球-检测抗体-目标蛋白-固相抗体-生物素,去除过剩标记抗体和过剩待测物。然后进行均相磁分离免疫检测:检测抗体、抗原、固定抗体在酶标板中进行ELISA。
其中目标蛋白可以是降钙素原(PCT),也可以是其他多种蛋白质生物标志物。以检测测降钙素原为例,该方法是以铕离子荧光微球为标记物,通过EDC/NHS活化铕离子荧光微球,偶联鼠抗人PCT抗体(检测抗体);在另一株鼠抗人PCT抗体(固相抗体)标记上生物素。检测抗体、抗原、固定抗体在96孔酶标板中进行ELISA实验,再通过表面修饰有链霉亲和素的磁珠分离游离的荧光微球-检测抗体-PCT-固相抗体-生物素,来去除过剩标记抗体和过剩待测物。本发明中所用的铕离子表面修饰有如羧基、氨基等功能性基团。
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