[发明专利]一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒

权利要求书

1.一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的检测引物组如下所示：

前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’；

后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’；

前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’；

后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’；

前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’；

后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’。

2.一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、MnCl₂溶液、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组如下所示：

前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’；

后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’；

前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’；

后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’；

前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’；

后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’。

3.根据权利要求2所述的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含欧文氏弧菌的pryH基因的质粒DNA。

4.根据权利要求2所述的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照质控品为不含欧文氏弧菌的pryH基因的DNA或超纯水。

5.一种非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对样品进行增菌培养获得增菌液，提取增菌液中的基因组DNA作为模板；

(2)使用权利要求1所述的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，与环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、MnCl₂溶液、钙黄绿素显色液及样品基因组DNA混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；

(3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和/或凝胶电泳分析检测样品中是否含有欧文氏弧菌。

6.根据权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有欧文氏弧菌具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有欧文氏弧菌；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有欧文氏弧菌。

7.根据权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有欧文氏弧菌具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有欧文氏弧菌；若无梯状条带，则样品中不含有欧文氏弧菌。

8.根据权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μL，包括1×Isothermal AmpBuffer、6mmol/L MgSO₄、1.4mmol/L dNTP Mix、1.6μmol/L FIP、1.6μmol/L BIP、0.2μmol/LF3、0.2μmol/L B3、0.4μmol/L LF、0.4μmol/L LB、320U/mL Bst 2.0DNA Polyme rase、1.2mol/L甜菜碱、1mmol/L氯化锰、1mmol/L钙黄绿素2μL和基因组DNA模板1μL，余量为去离子水。

9.根据权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应的反应条件为：65℃反应60min，80℃终止反应10min。