[发明专利]一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。该检测引物组为：前外引物F3：5’‑CATACAGCTCTGCGTCTG‑3’；前内引物FIP：5’‑GCGG ATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA‑3’；后内引物BIP：5’‑GCCAAGGCCGTGTA GTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA‑3’；前环引物LF：5’‑CGGAATTGCAGACATTAC GC‑3’；后环引物LB：5’‑CTCTGCAGGTACTGGTAACC‑3’。本发明的检测引物组、检测试剂盒和检测方法具有特异性强，操作方便简单，检测时间短等优点，其反应过程不需要昂贵的仪器设备，反应结果可视化，直接通过肉眼观察即可判断，适合于现场快速检测的推广使用。

技术领域：

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

欧文氏弧菌(Vibrio owensii)是海洋中一种具有强毒力的肠道病原菌，可引发对虾急性肝胰腺坏死症，也可诱发锦绣龙虾在叶状幼体时期快速病变死亡，同时也是蔷薇珊瑚的致病菌，可感染珊瑚，导致珊瑚白化死亡。关于欧文氏弧菌致病以及如何检测防治的报导并不多见，早期对欧文氏弧菌的检测方法只是停留在一些比较传统的微生物分类鉴定以及传统的PCR检测技术。近期，关于欧文氏弧菌的检测方法有了新的进展，等温重组聚合酶扩增法，可以准确快速的检测出欧文氏弧菌，但此法需要用等温扩增荧光检测系统来检测和记录荧光信号的变化，而往往野外基层现场检测需要快速简便的方法，尽可能避免使用昂贵的仪器设备和繁琐的操作过程。

环介导等温扩增(loop-mediated isothemal amplification,LAMP)技术是2000年，Notomi等开发的一种恒温核酸扩增方法。其主要特点是，LAMP引物设计主要针对靶基因的6个不同区域，设计4条特异性引物，部分软件经过改进后可以设计6条特异性引物，从而加速了核酸在反应中的合成速度。DNA模板在链置换型DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)的作用下，于65℃恒温扩增30-60min，便可合成大量核酸，具有操作简便、快速、特异性强、结果可肉眼判断等优点，具有很广阔的应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性强、操作方便简单、无需昂贵的仪器设备的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。

本发明利用环介导等温扩增技术，以欧文氏弧菌的pryH基因(Genebank登录号为GU111253.1)为特异靶基因，设计、筛选并优化特异性引物，建立一种LAMP检测方法，并优化反应条件，在反应过程中添加阳性对照组和阴性对照组，并通过钙黄绿素显色法和凝胶电泳分析检测样品组和其他两组对照的扩增产物来判断样品中是否含有欧文氏弧菌，以达到方便简单，经济快速而且灵敏的检测效果，进而实现本发明的目的。

本发明的第一个目的是提供欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，所述的检测引物组如下所示：

前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’(如SEQ IDNO.4所示)；

前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’(如SEQ ID NO.6所示)。