[发明专利]沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子及筛选方法与应用

权利要求书

1.沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，其特征在于，所述小核糖核酸分子的序列信息为：

正义，GGGAUUGGUUAAUGCUCAUTT(5′–3′)；

反义，AUGAGCAUUAACCAAUCCCTT(5′–3′)。

2.如权利要求1所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，构建重组表达质粒pNS1-EGFP；

步骤1.1，根据H5N1型禽流感病毒NS1基因序列，参照pEGFP-N1载体信息，设计NS1真核表达引物F、R；同时将所述pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI分别作为上、下游引物的酶切位点；

步骤1.2，以cDNA为模板，取步骤1.1中引物F、R进行降落PCR扩增NS1CDS编码区，随后将扩增出的目的片段电泳，最后纯化回收扩增出的目的片段；

步骤1.3，将步骤1.1的pEGFP-N1载体与步骤1.2的目的片段同时经XhoI和EcoRI双酶切消化，经电泳回收到线性化载体与扩增产物；然后在T4DNA连接酶的介导下4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG蓝白斑筛选，挑取单克隆进行菌落PCR初步鉴定，将阳性重组子摇菌，提取质粒，XhoI和EcoRI双酶切鉴定，得到重组表达质粒pNS1-EGFP；

步骤2，稳定表达H5N1型禽流感病毒的NS1-EGFP稳定细胞系构建；

步骤3，根据NS1基因的序列，合成针对NS1基因的四个小干扰核糖核酸分子siRNAs；

步骤4，使用高效转染试剂，将步骤3中四条小干扰核糖核酸分子siRNAs转染步骤2的NS1-EGFP稳定细胞系；

步骤5，经过步骤4的转染48h后，利用实时荧光定量聚合酶链式反应、流式细胞术以及Western-blot检测siRNA的抑制效果，从而筛选出其中能特异且最有效沉默H5N1型禽流感病毒NS1基因表达的小核糖核酸分子。

3.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤1.1中NS1真核表达引物F、R具体为：

F:5’-GCGCCTCGAGATGGATTCCAACACTGTG-3’；

R:5’-CGCGGAATTCCTTTGGAGAGAGTGGAGG-3’；

其中引物F、R中下划线位置处分别为pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI的上、下游引物的酶切位点。

4.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤1.2中降落PCR扩增NS1CDS编码区的反应体系为50μL，具体为：模板cDNA 1.5μL，上、下游引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 26μL，灭菌蒸馏水20.5μL；

所述降落PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s；72℃延伸2min；依次循环以上扩增条件；

当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到44℃，再按照94℃预变性3min；94℃变性30s，44℃退火30s；72℃延伸2min进行22个循环反应；最后，72℃后延伸10min。