[发明专利]沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子及筛选方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程及生物技术药物技术领域，具体涉及一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，本发明还涉及一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法与应用。

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种能够在禽类和人类之间相互传播的传染病，严重威胁着全球范围内的禽类养殖业，也日益威胁着人类健康。世界动物卫生组织(OIE)将AI分为3类：高致病性、低致病性和非致病性。我国将高致病性AI列为一类动物疫病，其中高致病性禽流感病毒H5N1亚型、以及2013年3月在人体上首次发现的新禽流感H7N9亚型尤为引人关注，不仅造成了人类的伤亡，同时重创了家禽养殖业。

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于正黏科病毒，其基因组主要由单股负链RNA组成，RNA含有8大小不同的片段，NS基因位于第8个片段，在感染初期翻译形成NS1蛋白，它是目前为止发现的唯一一个非结构蛋白，主要以二聚体的形式存在于核内，分子量为24kD，它是一种多功能调节蛋白，主要作用是通过调控干扰素和肿瘤坏死因子的释放而抑制宿主蛋白的合成。NS1蛋白的功能主要包括两个方面：首先，它是AIV的主要毒力因子，对病毒的感染、复制和变异具有重要影响，它可以与宿主细胞核蛋白相互作用，阻断细胞核mRNA的运输，从而抑制宿主蛋白的生物合成；其次，它能够拮抗干扰素和肿瘤坏死因子的分泌，有报道称NS1基因敲除病毒比亲本病毒诱导宿主产生干扰素和肿瘤坏死因子的含量更高。AIV形态呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜，依据其外膜血凝素(H)/和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。感染人类的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株(H5N2、H7N7、H9N2)，可经6～9个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株(H5N1)。

核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)是指由特定双链核糖核酸(double stranded RNA，dsRNA)引发同源信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)降解的转录后基因沉默机制。这类特定双链核糖核酸被裂解成小干扰核糖核酸分子(siRNAs)，并能导致同源信使核糖核酸(mRNA)在核糖核酸诱导的静默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)作用下降解。核糖核酸干扰(RNAi，Ribonucleic acid interference)RNA是目前简单而高效地阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法之一，可达到基因敲除效果，且安全性好。但对于核糖核酸干扰(RNAi)来说，并不是所有针对靶基因信使核糖核酸(mRNA)序列随机设计的小干扰核糖核酸分子(siRNAs)都能引起有效的基因沉默，干扰靶序列的选择对干扰效率的影响是至关重要的。因此，对能有效抑制特异基因表达的小干扰核糖核酸分子(siRNAs)的筛选是应用核糖核酸干扰(RNAi)技术进行基因功能、基因治疗等相关研究的重要基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，能够有效沉默禽流感病毒亚型H5N1中NS1基因表达，为开展靶向H5N1型禽流感病毒NS1基因表达的基因功能、基因治疗的相关研究提供了依据。

本发明的第二个目的是提供一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法。

本发明的第三个目的是提供一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的应用。

本发明所采用的技术方案是，沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，小核糖核酸分子的序列信息为：

正义，GGGAUUGGUUAAUGCUCAUTT(5′–3′)；

反义，AUGAGCAUUAACCAAUCCCTT(5′–3′)。

本发明所采用的第二个技术方案是，沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1，构建重组表达质粒pNS1-EGFP；

步骤1.1，根据H5N1型禽流感病毒NS1基因序列，参照pEGFP-N1载体信息，设计NS1真核表达引物F、R；同时将所述pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI分别作为上、下游引物的酶切位点；