[发明专利]一种来源于白曲霉的单胺氧化酶用于手性胺中间体的制备

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及基因工程、生物转化和生物催化、有机合成技术，公开了一种来源于白曲霉的单胺氧化酶基因及其在催化不对称氧化反应制备手性胺中间体中的应用。本发明单胺氧化酶AaMAO7‑6基因为1527 bp，编码由509个氨基酸组成的单胺氧化酶。本发明单胺氧化酶基因构建的重组菌单胺氧化酶表达后，全细胞或者酶用于转化顺式‑7‑氮杂双环[3,3,0]辛烷，生成特拉瑞韦（Telaprevir）的关键手性中间体。本发明具有反应条件温和，立体选择性高，易于工业化等优点。

技术领域

本发明属于应用微生物与酶工程领域，具体涉及一株白曲霉及其基因组编码的一种新型单胺氧化酶，并利用来源于该菌株的单胺氧化酶作为生物催化剂制备若干手性胺中间体。

背景技术

手性胺是重要和关键的药物结构单元，目前约40%的药物含有手性胺结构，手性胺高效制造技术是手性药物制造工业进步与发展所必须的关键技术。目前，手性胺的制备主要以化学不对称拆分和合成为主，生物催化制造手性胺则主要采用脂肪酶和转氨酶作为催化剂，对单胺氧化酶（MAO）的研究和使用较少。

光学活性Δ¹-吡咯烷类化合物是制备很多药物的关键手性中间体，这些分子中包含多个手性中心，合成难度极高。例如，(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸是治疗丙型肝炎药物特拉瑞韦（Telaprevir）的关键手性中间体，该药物由Vertex公司与强生公司联合开发。

采用手性酸试剂通过非对应异构体结晶成盐的拆分方法仍是目前获得光学纯手性胺的主要方法,但理论收率仅有50%成为这一技术的最大弊端。利用过渡金属催化亚胺不对称氢化还原是获得手性胺的另一重要途径，然而这一方法也存在很多不足：如需要活化的亚胺底物；需要使用过渡金属，如Rh，Ru，Ir和Ti，但昂贵的价格限制了它们在工业化中的应用。

近年来，随着生物催化技术的不断发展，研究者们积极探索发现和挖掘新酶作为生物催化剂用于手性胺的合成。采用单胺氧化酶不对称氧化消旋胺底物来获得光学纯手性胺的研究目前还主要停留在实验室研发阶段，成果主要集中在国外几个课题组，如英国的turner小组。

为获得高效的手性胺催化工艺，首先应解决单胺氧化酶来源极其有限的问题，迄今为止成功应用的只有黑曲霉单胺氧化酶。从环境中筛选新型微生物菌株作为催化剂是常用的有效途径之一。然而原始菌株直接转化可能存在安全性、遗传稳定性问题，原始菌株内的其他酶可能对底物作用生成副产物等问题，因此将原始菌株的关键单胺氧化酶基因克隆并异源表达，以重组菌或者酶用于生物转化则可避免上述问题，且这种催化体系较为简单，稳定，产物分离提纯容易，易于工业化。

发明内容

本发明的目的是公开一个产自新筛选的白曲霉（Aspergillus albicans 14）的高对映选择性单胺氧化酶AaMAO7-6，并利用该酶与化学磺化反应相偶联，一锅法反应构建含三个手性中心且水溶性和稳定性更好的光学纯(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-磺酸钠中间体，再通过化学腈化和水解，得到高光学纯度的特拉瑞韦（Telaprevir）关键手性中间体(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸。

基于上述发明目的，本发明首先提供一种单胺氧化酶AaMAO7-6。该酶是从一株白曲霉（Aspergillus albicans 14）中通过基因狩猎法克隆调取出来的。该菌从植物园土壤中富集、分离并经过多轮筛选后获得。