[发明专利]生物样品中降解酶和非降解酶的检测、鉴定与纯化

权利要求书

1.一种鉴定复杂生物样品中的蛋白酶活性的方法，包括：

a)获得复杂生物样品；

b)将该复杂样品与底物文库和标签孵育，以产生裂解产物；

c)将裂解产物与复杂样品分离；和

d)产生复杂样品的蛋白水解特征。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述复杂生物样品是全血。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述底物文库是合成肽文库。

4.如权利要求3所述的方法，其中，合成肽文库包含以下的组合：氨基酸对，带正电和带负电的残基，或沿合成肽长度的不同位置处的修饰残基。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述标签是荧光染料、放射性探针，或亲和标签。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述裂解产物通过凝胶电泳、毛细管电泳或DC和AC动电学技术的组合将与复杂样品分离。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述底物特征通过根据迁移检测和对肽混合物中的个体底物进行分级来产生。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述个体底物通过标签检测。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述标签是荧光染料、放射性探针，或亲和标签。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白水解特征包含多个蛋白酶活性类别。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述多个蛋白酶活性类别选自丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬氨酰，和金属肽酶活性。

12.如权利要求10所述的方法，其中，所述多个蛋白酶活性类别通过将复杂样品与活性抑制剂分开孵育来检测。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述活性抑制剂选自金属螯合剂、半胱氨酸肽酶抑制剂和弹性蛋白酶特异性抑制剂。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述活性抑制剂选自EDTA、E-64、CAO74，和氯甲基酮抑制剂。

15.一种纯化生物样品中的蛋白酶的方法，包括：

a)获得生物样品；

b)使所述样品与基于活性的探针(ABP)接触，所述基于活性的探针包含与带正电的部分连接的化学反应性基团，其中，该ABP结合生物样品中的蛋白酶的活性位点，并且该ABP的带正电的部分保持暴露在蛋白酶活性位点外；和

c)分离已结合ABP的蛋白酶。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述化学反应性基团通过间隔分子与带正电的部分连接。

17.如权利要求15所述的方法，其中，接触通过将ABP与样品体外孵育来进行。

18.如权利要求15所述的方法，其中，所述化学反应性基团与活性位点亲核残基不可逆地反应。

19.如权利要求15所述的方法，其中，已结合ABP的蛋白酶通过电泳分离与样品分离。

20.一种观察生物样品中的蛋白酶的方法，包括：

a)获得生物样品；

b)使所述样品与基于活性的探针(ABP)接触，所述基于活性的探针包含与带正电的部分连接的化学反应性基团，其中，该ABP结合生物样品中的蛋白酶的活性位点，并且该ABP的带正电的部分保持暴露在蛋白酶活性位点外；和

c)观察已结合ABP的蛋白酶。