[发明专利]生物样品中降解酶和非降解酶的检测、鉴定与纯化

说明书

提供了鉴定、观察和纯化来自复杂生物样品的蛋白酶的方法。

相关申请交叉引用

本申请要求2016年10月11日提交的美国临时申请系列号62/406,781的优先权，其通过引用全文纳入本文。

技术领域

本公开一般涉及检测复杂生物样品中蛋白酶活性的方法，具体是在无需样品处理的情况下，检测复杂生物样品(例如血液、血浆或血清)中降解和非降解酶活性的方法。

背景技术

已经鉴定了超过300种蛋白质翻译后修饰，它们大幅影响蛋白质功能，定位，活性和结构。常见的翻译后修饰包括磷酸化，糖基化，小蛋白质如泛素和SUMO(小泛素相关修饰物)的偶联，以及N末端和赖氨酸残基的乙酰化，但蛋白质的蛋白水解修饰的重要性和普遍性往往被忽视。实际上，许多疾病的生物标志物是生物体液中的稳定蛋白水解片段。

蛋白酶是在蛋白质和多肽内进行肽键水解的酶。除了它们在消化和蛋白质转换中的作用外，蛋白酶在严格调控的级联和信号转导事件中起作用。通过精确的蛋白水解加工，蛋白酶参与每个生物过程，包括DNA复制和修复，细胞周期进程，细胞增殖，分化和迁移，形态发生和组织重塑，神经元突触生长，止血，伤口愈合，免疫，血管生成和细胞凋亡。实际上，人们已经认识到超过53种特定的蛋白水解遗传性疾病，因此蛋白酶与许多病症有关并不奇怪。此外，许多病原体在侵入其宿主期间利用蛋白酶，在宿主内复制，或调节宿主的免疫应答。

由于这些原因，认为蛋白酶是治疗介入的重要靶标。蛋白酶占药物靶标的5-10％。有六类蛋白酶占任何生物基因的约2％(参见肽酶数据库MEROPs获取有用信息)，次于泛素连接酶，蛋白酶构成人类第二大酶家族，总共有超过567种蛋白酶。已经开发了几种蛋白酶抑制剂用于抗HIV感染，多发性骨髓瘤和高血压等疾病的药物。尽管取得了这些成功，但由于对靶向的蛋白酶功能作用缺乏选择性或有错误认识，许多蛋白酶抑制剂在临床试验中失败。

这些例子强调了在作为早期药物发现过程、生命科学研究和诊断开发的一部分的更复杂和生物学相关的环境中更好地理解蛋白酶活性的重要性。

发明内容

本文提供了检测复杂生物样品中的蛋白酶活性的方法，尤其是在无需样品处理的情况下，检测复杂生物样品中降解和非降解酶活性的方法。在一些实施方式中，复杂生物样品选自血液、血浆和血清。

本文提供了鉴定复杂生物样品中蛋白酶活性的方法，包括：a)获得复杂生物样品；b)将该复杂样品与底物文库和标签孵育，以产生裂解产物；c)从该复杂样品分离裂解产物；和d)产生复杂样品的蛋白水解特征。

在所述方法的一些实施方式中，复杂生物样品是全血。

在所述方法的一些实施方式中，底物文库是合成肽文库。在一些实施方式中，合成肽文库包含以下部分的组合：氨基酸对，带正电和带负电的残基，或沿合成肽长度的不同位置处的修饰残基。

在所述方法的一些实施方式中，通过凝胶电泳，毛细管电泳或DC和AC动电学技术的组合将裂解产物与复杂样品分离。

在所述方法的一些实施方式中，通过根据迁移检测和对肽混合物中的个体底物进行分级来产生底物特征。在一些实施方式中，个体底物通过标签检测。在一些实施方式中，标签是荧光染料，放射性探针或亲和标签。

在所述方法的一些实施方式中，蛋白水解特征包含多类蛋白酶活性。在一些实施方式中，多类蛋白酶活性选自丝氨酸，半胱氨酸，苏氨酸，天冬氨酰和金属肽酶活性。在一些实施方式中，通过将复杂样品与活性抑制剂分开孵育来检测多类蛋白酶活性。在一些实施方式中，活性抑制剂选自金属螯合剂、半胱氨酸肽酶抑制剂和弹性蛋白酶特异性抑制剂。在一些实施方式中，活性抑制剂选自EDTA，E-64，CAO74和氯甲基酮抑制剂。