[发明专利]猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中应用

权利要求书

1.一种猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌，其特征在于：所述菌株命名为streptococcus suis type 2△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，简称为：△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，其保藏编号为：CCTCC NO：M2016584；所述猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌由以下方法制备而成：

1)以猪链球菌2型05ZYH33株全基因组为模板，设计敲除cpsEF基因和ssna基因的引物、以及构建sly基因点突变的引物对，

其中，敲除cpsEF基因引物包括cpsEF上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对；

敲除ssna基因的引物包括ssna上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对；

构建sly基因点突变的引物对包括ssna上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对，以及353位点点突变的引物；其中，

a.构建敲除cpsEF基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

ECORI-E-1：AAAGAATTCGGCTCGTGCTATATTCTCTTGG，

RONGHE-EF-2：GAATCTTTTTCATAACAGCTCCTCCACTATTTC；

下游同源臂正反向引物：

RONGHE-EF-1：GAAATAGTGGAGGAGCTGTTATGAAAAAGATTC，

BAMHI-F-2：AAAGAATCCGGTTTGCCACAGCCTGTG；

b.构建敲除ssna基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

DSsnA-LF1:GGCGAATTCTGTTCGCATCAGTCGTAG，

DSsnA-LR1:GAACCAGGGCGTATCTCTTCATATAAAACTCCTTTTTGTTAT；

下游同源臂正反向引物：

Dssna-RL1:GAAAGATCGCCGTGTAATCATTTTTTGAGCTTGAAAGCATGAC，

Dssna-RR1:CGAGGATCCCAATTTCAACCTCGGTCGCTC；

c.构建SLY基因点突变的引物

上游同源臂正反向引物：

SLY-SacI-L1：ACCATTAGAGCTCAATTTTGATGCCGTG，

SLY(P353L)-R1：

TCTCCACCACTCAAATAAATTGAGTTTTCCG；

下游同源臂正反向引物：

SLY(P353L)-L2：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-BamHI-R2：

GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；

353位点点突变的引物：

SLY-P353L-L：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-P353L-R：

GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；

2)从猪链球菌2型野生菌株SC19中提取细菌基因组；

3)以细菌基因组为模板，用上述cpsEF上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对进行PCR，纯化回收得到上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物，将上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物进行融合PCR，得到融合产物cpsEF-LR；

4)用EcoRI和BamHI将融合产物cpsEF-LR和载体pSET4s分别进行双酶切，并将产物cpsEF-LR和线性化的载体pSET4s连接，得到重组质粒pSET4s-cpsEF；

5)将猪链球菌2型菌株SC-19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-cpsEF加入到SC-19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布TSA平板上培养，得到单菌落；鉴定该菌落并命名为缺失突变体△cps-SC19；

6)以细菌基因组为模板，用上述ssna上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对进行PCR，纯化回收得到上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物，将上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物进行融合PCR，得到融合产物ssna-LR；

7)用EcoRI和BamHI将融合产物ssna-LR和载体pSET4s分别进行双酶切，并将产物ssna-LR和线性化的载体pSET4s连接，得到重组质粒pSET4s-ssna；

8)将cps基因敲除的突变菌株△cps-SC19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-ssna加入到△cps-SC19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布平板上培养，得到单菌落；鉴定该菌落并命名为缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19；

9)以细菌基因组为模板，用sly上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对进行PCR，纯化回收得到上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物，将上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物进行融合PCR，得到融合产物sly-del353；应用sly上游同源臂的正向引物SLY-SacI-L1和下游同源臂的反向引物SLY-BamHI-R2扩增sly全长基因片段；

10)用SacI和BamHI将融合产物sly-del353、sly全长基因片段和载体pSET4s分别进行双酶切，得到线性化的融合产物sly-del353、线性化的基因组全长基因片段sly和线性化的载体pSET4s；将线性化的融合产物sly-del353和线性化的基因组全长基因片段sly分别与线性化的载体pSET4s连接，得到两个重组质粒，命名为pSET4s-sly-del353和pSET4s-sly-LR；再以pSET4s-sly-LR为模板，用353位点点突变的引物对进行PCR，得到质粒pSET4s-sly；

11)将猪链球菌缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-sly-del353加入到△cps/ssna-SC19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布得到平板上培养，得到单菌落；鉴定该菌落并命名为缺失突变体△sly/cps/ssna-SC19；

12)将缺失突变体△sly/cps/ssna-SC19制作电转感受态细胞，将pSET4s-sly质粒电转到感受态细胞中，利用温度和抗性诱导质粒和细菌基因组发生重组交换，利用SLY-SacI-L1、SLY-BamHI-R2引物进行PCR扩增，能扩增得到且仅有一条1200bp条带的菌株，为筛选得到正确的菌株，命名为猪链球菌cps和ssna基因敲除以及溶血素基因定点突变菌株streptococcus suis△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，即猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌。