[发明专利]两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白及其编码基因的应用

说明书

本发明提供了两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白，来源于杨梅果实的双加氧酶家族，其氨基酸序列SEQ:NO.18和SEQ:NO.19所示。在杨梅果实发育过程中，MrFLS1基因表达与黄酮醇累积呈正相关关系，MrFLS2则在果实成熟时高表达，与后期黄酮醇含量增加相关。本发明验证了MrFLS1和MrFLS2基因的功能，原核表达体外验证表明，MrFLS1和MrFLS2蛋白均可将二氢山奈酚催化生成山奈酚、将二氢槲皮素催化生成槲皮素，且MrFLS2具有较高催化效率；在烟草中过量表达MrFLS1或MrFLS2，转基因植株的黄酮醇含量均显著增加。本发明可在工程微生物菌及植物遗传转化中的应用。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及重组蛋白和基因工程，具体涉及两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白及其编码基因的应用。

技术背景

FLS(EC 1.14.11.23)属于FeⅡ/2-酮戊二酸盐依赖性双加氧酶家族，是合成黄酮醇化合物必不可少的关键酶之一，在2-酮戊二酸盐和氧气存在的条件下，它催化二氢黄酮醇发生去饱和反应，生成黄酮醇、琥珀酸盐、二氧化碳和水。黄酮醇广泛存在于植物根、茎、叶、花、果实和种子中，对植物生长发育和抵抗逆境等发挥着重要作用，包括调控生长素转运、促进侧根形成、影响花粉发育、抗紫外线、调节叶片气孔开度等。FLS基因在转录水平上的表达模式与植物黄酮醇的积累密切相关。拟南芥种子萌发过程中，白光照射能引起AtFLS1在不同组织中的差异性表达，并导致黄酮醇不同程度的积累。反义NtFLS后，烟草中无法检测到黄酮醇，而花粉也不能正常萌发成花粉管。

杨梅(Morella rubra)属于我国特色水果，具有很好的医药学活性，这与其较高的黄酮类化合物含量密不可分，而黄酮醇是杨梅中主要的黄酮类化合物，通常以糖苷衍生物形式存在于液泡中。大量研究报道了黄酮醇抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病、消炎等医药学活性。富含黄酮醇的植物可用于生产保健食品、药品，具有广阔的开发应用前景。

鉴别出参与杨梅果实黄酮醇生物合成相关的FLS，对于阐明杨梅果实黄酮醇生物合成机制具有重要意义，为开发工程微生物菌奠定基础，且可指导研究单一黄酮醇化合物分流机制。

发明内容

本发明的目的是提供两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白，来源于杨梅果实的双加氧酶家族，是两个参与杨梅黄酮醇生物合成的关键基因MrFLS1和MrFLS2，其氨基酸序列如SEQ:NO.18和SEQ:NO.19所示，其编码的核苷酸序列如SEQ:NO.1和SEQ:NO.2所示。

本发明的另一个目的是提供所述的两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白在工程微生物菌及植物遗传转化中的应用。利用原核表达技术将pET28a-MrFLS1或pET28a-MrFLS2重组质粒转化BL21(DE3)，诱导出的蛋白均可将二氢山奈酚催化生成山奈酚、将二氢槲皮素催化生成槲皮素；利用基因工程技术获得高表达MrFLS1或MrFLS2的烟草转基因植株，相较于野生型，转基因株系中黄酮醇含量显著增加。

本发明提供的基因特征如下：

(1)基因表达特征：随着杨梅果实发育，MrFLS1表达先降后升，与杨梅黄酮醇的变化趋势一致，MrFLS2则在杨梅果实成熟时高表达，与后期黄酮醇含量增加相关；

(2)基因功能特征：(1)大肠杆菌BL21(DE3)表达PET28a-MrFLS1或PET28a-MrFLS2重组载体，诱导表达出的蛋白均可将二氢山奈酚催化生成山奈酚、将二氢槲皮素催化生成槲皮素，说明MrFLSs编码的蛋白具有黄酮醇合成酶活性，能够将二氢黄酮醇转化为黄酮醇；

(3)利用基因工程技术获得过表达MrFLS1或MrFLS2的转基因烟草植株，与野生型相比，转基因株系花中黄酮醇含量显著上升。