[发明专利]一种制备细菌菌影的方法

说明书

本发明涉及一种制备细菌菌影以及基因工程亚单位疫苗的方法，包括将INP信号序列和外源基因以及裂解盒基因E‑lysis克隆到同一个表达载体，转化细菌，其中INP的信号序列为SEQ ID NO：1表示的序列，裂解盒基因E‑lysis的序列为SEQ ID NO：2表示的序列，以及表达外源基因的重组细菌菌影在制备疫苗中的应用。

技术领域

本发明涉及细菌表面展示技术，即利用信号序列INP作为外源抗原蛋白的引导序列，将外源抗原蛋白定位于细菌的表面；本发明还涉及细菌菌影制备技术，将细菌表面展示技术与细菌菌影制备技术融合在一起，建立了细菌菌影表面展示技术平台。属于基因工程疫苗领域。

背景技术

细菌菌影(Bacterial ghost)是一种没有细胞浆和核酸的空细菌体。将PhiX174噬菌体E打孔基因在细菌中表达，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和胞壁上可形成穿膜孔道，在渗透压的作用下使菌体破裂，细菌胞内细胞浆和核酸成分通过此孔道被排出，形成一种空的细菌外壳，即为细菌菌影。菌影是由内膜(cytoplasmic membrane)，胞浆间隙(periplasmic space)和外膜(outer membrane)组成，因此细胞壁在很大程度上被完整保存下来。在有些菌株的外膜上还有一层S-layer，也成为菌影的成分之一。菌影本身可作为一种很好的疫苗，因为这种形式保留了和活菌一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫细胞通过模式识别受体识别的高度保守结构PAMP(pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖，肽聚糖，CPG，OmpA，菌毛等，能有效地被DC和巨噬细胞所吞噬。目前，菌影通过静脉、皮下、气体等途径免疫已经在小鼠、兔子、猪等动物模型中取得了良好的免疫保护效果。霍乱菌菌影(VCG) 经皮下注射小鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱特异性IgG抗体。同时显示，针对VCG的抗体足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。

另外，细菌菌影还可以用作一种极好的递呈系统，通过在细菌裂解之前对细菌进行外膜的人工改造，将外来抗原，核酸或药物等其它成分锚定于胞膜的内、外侧，或充于胞浆周质。这样制备的重组菌影拥有完好的，天然的细菌外膜结构，能同时激发体液和细胞免疫应答。其菌毛等表面黏附结构，又使之能靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道和呼吸道的黏膜表面，进而较易被机体吞噬细胞，如PP结(Peyer’s Patches)的M 细胞所识别捕获，故而可有效递送疫苗抗原至黏膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。Eko等人将沙眼衣原体(C.trachomatis)抗原在霍乱菌的内膜表达，然后裂解制备的重组菌影(VCG)有效地激发了生殖道黏膜的Th1型免疫应答，现在正在着手进行临床实验。与传统的原核系统表达蛋白相比，重组菌影有几大优势：(1)重组蛋白被整合在一个具有高度免疫原性的环境中；(2)对蛋白的大小要求范围宽泛，但蛋白的分子量最好在2000 到200,000Da之间；(3)重组蛋白被直接表达后整合到细菌的膜上，裂解后就能直接用于免疫动物，而不必要象以前制备免疫原时要先分离纯化重组蛋白；(4)整合在细胞壁的重组蛋白具有天然的构象，所以保持了它原有的活性形式。而一般基因重组的蛋白通过原核系统大都以包涵体的形式表达，只能通过变性、复性的方法在一定程度上恢复蛋白活性。(5)菌影的制备相对简单，可用发酵技术获得，而不需进行复杂的纯化工作；可以冻干的形式贮存于室温。

发明内容

本发明的目的是建立一种全新的、基于细菌菌影的表面展示技术平台，为基因工程疫苗的研制开辟一个新的领域，提供一个有力的工具。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种信号序列INP，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示；一种裂解盒基因E-lysis，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

在本发明的一个方面，提供了一种制备细菌菌影的方法，包括将INP 信号序列和裂解盒基因E-lysis克隆到同一个表达载体，转化细菌，其中 INP的信号序列为SEQ ID NO：1表示的序列，裂解盒基因E-lysis的序列为SEQ ID NO：2表示的序列。