[发明专利]高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌以及制备方法

权利要求书

1.一种高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于：它是通过将枯草芽孢杆菌进行基因敲除后获得；所敲除的基因包括芽孢形成编码基因spo0A，淀粉酶编码基因amyE，部分蛋白酶编码基因bpr、mpr、epr、vpr、wprA、aprX，聚谷氨酸合酶编码基因pgsB；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌枯草亚种，其保藏编号为CICC 20637。

2.权利要求1所述高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌的制备方法，包括如下步骤：

1）根据目标基因上下游同源臂序列设计敲除引物，引物末端和载体末端具有15~20个同源碱基；

2）PCR扩增：提取枯草芽孢杆菌总DNA，以其作为模板，用各基因对应的上、下游同源臂引物进行PCR扩增，得到目的同源臂DNA片段；

3）通过SOE-PCR分别将各基因的上下游同源臂连接起来，得到9个基因敲除片段；

4）通过无缝克隆将基因敲除片段连接到敲除载体上，得到对应的9个目标基因敲除载体；

5）枯草芽孢杆菌的遗传转化，对枯草芽孢杆菌感受态的制备及利用1个目标基因敲除载体进行电转化；

6）通过抗性筛选和PCR扩增对转化子进行验证；

7）挑选阳性转化子进行传代，经过高温传代，质粒消除，点种和PCR验证后，筛选出目标基因敲除菌株；

8）在得到目标基因敲除菌株后，以其为出发菌株，重复步骤5）~7）用同样的方法对下一个目标基因进行敲除，直至得到敲除9个基因的目标菌种。