[发明专利]高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌以及制备方法

说明书

本发明公开了一种高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌以及制备方法。本发明通过基因敲除技术，改造现有的枯草芽孢杆菌菌种，得到了一种高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌。该方法路线清晰，简单有效，可以运用于多种枯草芽孢杆菌，具有较好的实用性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是指一种高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌以及制备方法。

背景技术

纤溶酶是能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶，具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。近年来，纳豆激酶(nattokinase，简称NK)作为一种高效安全的新型纤溶酶，正在成为当今溶栓药研究的焦点。

该酶是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，自1995年我国第一篇有关纳豆和纤溶酶的报道以来，至今已有多篇相关文章发表，目前纤溶酶的溶栓机制已阐明，包括①直接溶栓作用，激活交联纤维蛋白，降解为纤维蛋白降解物；②刺激血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，t-PA将纤溶酶原激活为纤溶酶，溶解纤维蛋白；③将人体内的尿激酶原激活为尿激酶，尿激酶与t-PA共同激活纤溶酶原，产生纤溶酶溶解血栓；④通过降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂(PAI-1)调控纤溶作用。此外，纤溶酶在体内外溶栓的动物试验、急性毒性试验及治疗脑梗塞的初步临床试验等方面的大量研究工作已部分完成或正在进行中。

纤溶酶的主要生产菌株——纳豆芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌的一种，是一类好氧型、内生抗逆孢子的革兰氏阳性细菌，能分泌大量的蛋白到胞外，其研究历史已经有40多年，遗传背景清楚，其表达系统已成为继大肠杆菌表达系统之后最重要的原核表达系统，优势在于：①没有毒性；②蛋白分泌表达量高；③密码子使用偏好性不大；④基础研究、基因操作技术和发酵技术成熟。

纤溶酶传统发酵方式是固体发酵，但该方式提纯困难，回收率低，难以满足工业化放大生产的要求，因此，近年来关于纤溶酶产量的研究更倾向于液体发酵方式。目前，纤溶酶生产菌株主要以筛选方式获得，发明专利申请CN105238720A和CN101979531A等多篇专利申请和发表文章均通过筛选获得高产纤溶酶菌株，发明专利申请CN105368762A通过菌株改造得到高效分泌纤溶酶工程菌株，但是，前者只通过筛选而未进行改造，后者只经过菌株改造而所用菌株并非纤溶酶高产菌，所以在纤溶酶产量及酶活方面，两者均没有明显优势。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有高产纤溶酶菌株在纤溶酶产量及酶活方面的缺陷，提供一种高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌及其制备方法。

为实现上述目的，首先，本发明提供一种高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于：它是通过将枯草芽孢杆菌进行基因敲除后获得；所敲除的基因包括芽孢形成编码基因spo0A，淀粉酶编码基因amyE，部分蛋白酶编码基因bpr、mpr、epr、vpr、wprA、aprX，聚谷氨酸合酶编码基因pgsB。

上述方案中，采用的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌枯草亚种，其保藏编号为CICC20637。

本发明还提供了上述高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌的制备方法，包括如下步骤：

1)根据目标基因上下游同源臂序列设计敲除引物，引物末端和载体末端具有15～20个同源碱基；

2)PCR扩增：提取枯草芽孢杆菌总DNA，以其作为模板，用各基因对应的上、下游同源臂引物进行PCR扩增，得到目的同源臂DNA片段；

3)通过SOE-PCR分别将各基因的上下游同源臂连接起来，得到9个基因敲除片段；

4)通过无缝克隆将基因敲除片段连接到敲除载体上，得到对应的9个目标基因敲除载体；

5)枯草芽孢杆菌的遗传转化，对枯草芽孢杆菌感受态的制备及利用1个目标基因敲除载体进行电转化；